Abstract
Bakgrunn
Til tross for intens forskning i oppdagelse tidlig kreft, er det en mangel på biomarkører for pålitelig påvisning av ondartede svulster, inkludert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). DNA metylering endringer er vanlige og relativt stabil i ulike typer kreft, og kan brukes som diagnostiske eller prognostiske biomarkører.
Metoder
Vi utførte DNA metylering profilering av prøver fra 48 pasienter med stadium I NSCLC og 18 matchende kreftfrie lunge prøver ved hjelp av mikromatriser som dekker promotorområdene på mer enn 14.500 gener. Vi korrelert DNA metylering endringer med genuttrykk nivåer og utført overlevelsesanalyse.
Resultater
Vi observerte hypermethylation av 496 CPGs i 379 gener og hypometylering av 373 CPGs i 335 gener i NSCLC. Sammenlignet med adenokarsinom prøver, plateepitelkarsinom prøver hadde 263 CPGs i 223 hypermethylated gener og 513 CPGs i 436 hypomethylated gener. 378 av 869 (43,5%) CpG nettsider kresne NSCLC og kontrollprøver viste en invers korrelasjon mellom CpG nettstedet metylering og genuttrykk nivåer. Som et resultat av en overlevelsesanalyse, fant vi 10 CPGs i 10 gener, karakterisert ved at metyleringen nivået er forskjellig i forskjellige overlevelses grupper.
Konklusjoner
Vi har identifisert et sett av gener med endret metylering i NSCLC og fant at et mindretall av dem viste en invers korrelasjon med genuttrykk nivåer. Vi har også funnet et sett av gener som er forbundet med overlevelse av pasientene. Disse nylig identifiserte markør kandidater til molekylær screening av NSCLC vil trenge ytterligere analyse for å fastslå deres kliniske nytte
Citation. Lokk K, Vooder T, Kolde R, Valk K, Võsa U, Roosipuu R, et al. (2012) metylering Markers på tidlige stadier av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (6): e39813. doi: 10,1371 /journal.pone.0039813
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 06.11.2011; Godkjent: 28 mai 2012; Publisert: 29 juni 2012
Copyright: © 2012 Lokk et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av EU gjennom European Regional Development Fund, Centre of Excellence i Genomics og prosjektet 245536 OpenGene. Ekstra støtte er hentet fra estiske departementet for utdanning og vitenskap kjerne stipend SF0180142s08, estisk Science Foundation tilskudd 7473, 9293 og Universitetet i Tartu utviklingsfond prosjekt translasjonell Genomics. LM har vært støttet av EU gjennom den europeiske sosialfondet, fellesskap MJD71. NT har vært støttet av fellesskap fra Alexander von Humboldt Foundation. KL, MK og NT har mottatt reisestipender fra Kristjan-Jaak Foundation. Nettsiden til OpenGene prosjekt: www.geenivaramu.ee/opengene/. Nettsiden til estisk Science Foundation: www.etf.ee. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i verden. Epigenetiske hendelser er tidlig og hyppig i karsinogenese [1], [2], [3], noe som gjør at DNA-metylering en attraktiv biomarkør for kreft. Epigenetiske hendelser kan også gi en medgjørlig kobling mellom genomet og miljø, med epigenome fungerer som en biokjemisk oversikt over aktuelle hendelser i livet, f.eks sigarettrøyking [4].
Lungekreft er morfologisk delt inn i ikke-småcellet og småcellet lungekreft (NSCLC og SCLC). NSCLC står for ca 80% av lungekrefttilfellene og er en heterogen klinisk enhet med store histologiske undergrupper som plateepitelkarsinom (SCC), adenokarsinom (AC) og stor celle karsinom [5]. Et fellestrekk ved de ulike subtyper av NSCLC er den noe lavere vekst og spredning i forhold til SCLC, slik at kirurgisk utrydding i en tidlig fase. Bare en mindre del av NSCLC tilfeller er i dag diagnostisert i kliniske faser jeg å IIb, hvor kirurgisk fjerning er behandling av valget.
biomarkør-drevet tilnærming til preinvasive faser kunne diagnostisering eller utelukker lungekreft. Nåværende markører, inkludert plateepitelkarsinom antigen, carcinoembryonic antigen, cytokeratin 19 fragment antigen 21-1 og neuron-spesifikk enolase ble vist å mangle tilfredsstillende diagnostisk makt. I en fersk undersøkelse, kunne bare 37,3% av tidlig stadium lungekreft diagnostiseres ved hjelp av kombinasjonsanalyser av de nevnte tumor markører [6].
Vår studie var rettet mot genom-wide identifisering av DNA metylering-baserte biomarkører kandidater i tidlig stadium NSCLC. DNA-metylering opptrer vesentlig i sammenheng med cytosin-guanin dinukleotider (CPGs) [7]. CpG-rike korte strekninger (CpG øyer) er vanligvis plassert i promotorområdet av gener og er normalt holdes i demetylert staten [8]. I kreft, CpG øyer som ligger i promoter område av tumorsuppressorgener og «vaktmester» gener blitt hypermethylated, noe som kan føre til redusert uttrykk av disse genene. Samtidig, blir genomet globalt demetyleres, som i sin tur kan føre til aktivering av onkogener [9], [10]. Metylering av CpG Island Shores – regioner med lavere CpG tetthet innenfor ca 2 kb av CpG øyer – er også nært knyttet til transcriptional inaktivering [11]
Nylig, betydelig fremgang har blitt gjort i genom-wide DNA metylering. analyse. Metodene omfatter bisulfitt omdannelse av DNA, immunopresipitering eller affinitetsrensing av metylert DNA etterfulgt av mikromatriseanalyse eller high-throughput-sekvensering [12]. Det har vist seg at når det gjelder presisjon, bisulfitt-baserte metoder utføre litt bedre enn berikelse-baserte metoder og krever ikke en statistisk korreksjon for CpG skjevhet [13].
Vi har utført et genom-wide DNA metylering studie av stadium i NSCLC å få et innblikk i tidlig stadium epigenetiske forandringer i lungekreft og identifisere potensielle diagnostiske eller prognostiske biomarkører. I vår studie brukte vi HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, Inc) som gjør det mulig kostnadseffektive kvantitative sammenligninger på tvers av mange eksempler.
Resultater
CpG Metylering Analyse
Totalt, vi har oppdaget 496 CPGs i 379 gener hypermethylated og 373 CPGs i 336 gener hypomethylated i NSCLC (figur S1, Tabell S1). En heatmap av de 100 mest annerledes denaturert gener i NSCLC sammenlignet med kontrollprøvene er vist i figur 1.
DNA metylering nivåer er vist for de 100 CpG områder med de høyeste delta Beta-verdier (FDR korrigert) av DNA metylering mellom cancervev og normalt lungevev. Metylering Beta-verdiene er representert som rad Z-score. En heatmap ble generert ved hjelp uten tilsyn 2D hierarkisk klyngeanalyse. Rødt indikerer høy metylering og blått indikerer lav metylering i forhold til raden mener.
I forhold til AC prøver, SCC prøver hadde 263 CPGs i 223 hypermethylated gener og 513 CPGs i 436 hypomethylated gener (Figur S2, Table S2).
To DNA-prøver (IDS 33 og 107) ble behandlet i to eksemplarer som en intern kontroll av analysen er reproduserbarhet. Pearsons korrelasjonskoeffisient for begge duplikater var 0,998. Metylering nivåer bestemt av infinium analysen ble validert ved hjelp Sanger-sekvensering av sulfitt-konvertert DNA for 11 CPGs (seks CPGs fra NSCLC versus kontrollprøver analyse og fem CPGs fra overlevelsesanalyse). Gjennomsnittlig korrelasjon mellom to metodene var 83% (fra 48,9%, 97,4%). (Figur S3)
CPG nettsider analysert av HumanMethylation27 analysen ligger innenfor 1,5 kb oppstrøms til en kb nedstrøms av TSS på deres respektive gener. Vi fant en signifikant forskjell i plasseringen av hypermethylated vs. hypomethylated CPGs forhold til nærmeste TSS (p = 0,0001, Welch Two Sample t-test). Hypermethylated CPGs ble fortrinnsvis plassert på TSSs, 3 «nedstrøms TSS eller i CpG øyer. I motsetning til dette hypomethylated CPGs ofte ble funnet 5 «oppstrøms av den respektive TSSs eller i CpG Island Shores [11] (tabell 1, figur 2).
Vi målte CPGs» avstand fra transkripsjonsstartsetet (TSS) . a) Avstand fra TSS av alle CPGs på metylering array. b) Avstand fra TSS av hypermethylated CPGs (stiplet linje) og avstand fra TSS av hypomethylated CPGs (kontinuerlig linje). På x-aksen, er avstanden fra TSS målt i bp-s, og på y-aksen N representerer antall CPGs.
Ulike CPGs av
HSPA12B
,
PABPC5 Hotell og
TP73
var enten hyper- eller hypomethylated i NSCLC. I
TP73
-genet, ble hypermethylated CpG området i tumorprøve lokalisert oppstrøms for TSS av full-lengde mRNA isoformen. Hypomethylated
TP73
CPGs ble plassert i nærheten av TSSs av de kortere isoformer. Hypermethylated CPGs av
HSPA12B Hotell og
PABPC5
ble plassert i sine 5 «CpG øyer, mens hypomethylated CPGs ble plassert oppstrøms, utenfor CpG øyer.
Gene Expression Microarray Validation ved QRT-PCR
Gene uttrykk rekke oppsett og resultatene er rapportert i nyere artikkel [14]. 10 gener og åtte prøve parene ble brukt til å validere microarray resultater, ved hjelp QRT-PCR-teknologi. Alle genene viste samme retning av over- eller underexpression i lungekreft prøvene ved bruk av både teknologier (figur 3). Syv gener viste en signifikant sammenheng mellom uttrykk fold-endringer fastsatt av QRT-PCR og microarray (p 0,05, R 0,7). (Figur S4)
På y-aksen er vist gjennomsnittlig log2fold- endre bestemmes av Illumina matrise og QRT-PCR (8 prøve par). Feilfelt indikere standard feil av gjennomsnittet (SEM).
Metylering relatert til Gene Expression Endrer
Ved hjelp av Pearsons korrelasjonsanalyse, var vi i stand til å bestemme den forventede invers korrelasjon mellom differensial metylering nivåer og genekspresjon verdier for 378 (43,5%) av 869 differensielt metylerte CPGs mellom NSCLC og kontrollprøver. I ulike histologiske gruppene var vi i stand til å finne 337 av 780 CPGs (43,2%), metylering nivåene som ble omvendt korrelert til genuttrykk nivåer.
Vi utførte en qPCR analyse av de forskjellige
TP73
isoformer for å teste om differensial metylering ved siden av TSSs forskjellige isoformer påvirker deres uttrykk nivå. QPCR analyse viste ingen statistisk signifikant forskjell (p-verdi 0,36, paret t-test) mellom uttrykket nivåer av de to isoformer i våre tumorprøver.
Oppfinnsomhet Pathway Analysis
utføres
i silico
funksjonell og samhandling analyser av forskjellig denaturert gener ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare (Oppfinnsomhet Systems, Redwood City, CA), og fant 78 nettverks kvalifiserte gener og 451 Funksjoner /Pathways kvalifiserte gener. Ved å inkludere de kjente direkte og indirekte veksel, ble den mest fremtredende representert genet nettverk relatert til tumor nekrose faktor (TNF, figur S5). Mesteparten av genene (n = 22) i nettverket ble hypomethylated, men noen gener (n = 7) ble også hypermethylated.
DNA Metylering relatert til røyke Behavior
Basert på tobakksrøyking pakke -years data, spurte vi om røyking påvirker DNA metylering mønstre i en svulst. En pasient som manglet røykedata ble ekskludert. Lineær regresjonsanalyse ble utført ved hjelp av Bioconductor Limma pakken. Analyse innen tumorprøver viste ingen differentially denaturert gener relatert til omfanget av tobakksrøyking. Sammenligning av begrenset antall ikke-røykere (n = 3, 6,4%) med røykere (n = 44, 93,6%) har vi funnet fire differensielt denaturert CpG-sider i tre gener (p 0,05, FDR justert), som alle er hypomethylated i røykere gruppe.
CXorf38
,
MTHFD2 Hotell og
TLL2
Altered Metylering og langsiktige overlevelse
Vi utførte to typer overlevelsesanalyser for å finne potensielle prognostiske metylering markører. Pasientene med bare opp til en måned overlevelse etter kirurgi (n = 2) ble ekskludert for å unngå eventuelle konfunderende påvirkning av postoperative komplikasjoner.
For det første, utførte vi en Kaplan-Meier overlevelsesanalyse på hver av CpG nettsteder ved å dele Beta verdier i lav, middels og høy metylering grupper. Vi bare rapportere resultater der alle gruppene var større enn fem pasienter. Som et resultat fant vi 10 CPGs i 10 gener, med metylering nivåforskjeller i forskjellige overlevelsesgrupper (figur 4). Pasienter med et medium metylering nivå av
UGT1A7, GPR171, P2RY12, FLJ35784 Hotell og
C20orf185
hadde bedre overlevelse enn pasienter med høyt nivå metylering. Pasienter med et medium metylering nivå av
CLEC11A Hotell og
GRIK3
hadde bedre overlevelse sammenlignet med lavt nivå metylering. Pasienter med lav metylering nivå av
CYP1A1 Hotell og
INGX
hadde bedre overlevelse enn de med middels nivå metylering. Pasienter med høy metylering nivå for
PIK3R5
hadde bedre overlevelse enn de med middels nivå metylering.
Vi utførte en overlevelsestest på hver av CpG nettsteder. De metylering verdiene er delt inn i 3 grupper: lav (0-0,25), middels (0,25 til 0,75) og høy (0.75-1). Som et resultat har vi funnet 10 CpG nettsider der metylering nivå er forskjellig i ulike overlevelsesgrupper. X-aksen viser overlevelse i år, og y-aksen viser total overlevelse.
For det andre, vi utførte differensial metylering analyse ved å kombinere Cox proporsjonal fareanalyse og Wilcoxon rank sum test. Vi fant 18 CPGs i 15 gener hos pasienter med 1-24 måneder overlevelse (n = 12) vs. pasienter med 60 måneder og lengre overlevelse (n = 15), p 0,05, og metylering forskjellen cut-off brukes. Fra ulikt denaturert gener,
DXS9879E product: (
LAGE3
),
RTEL1 Hotell og
MTM1
ble hypermethylated, og
SCUBE3
,
SYT2
,
KCNC3
,
KCNC4
,
GRIK3
,
CRB1
,
SOCS2
,
ACTA1
,
ZNF660
,
MDFI
,
ALDH1A3 Hotell og
SRD5A2
ble hypomethylated i gruppen med dårlig overlevelse (figur S6).
Diskusjoner
Vi har utført et genom-wide DNA metylering studie i 48 stadium i NSCLC pasienter og 18 makroskopisk kreftfrie kontrollprøver ved hjelp av klyngeanalyse for å søke etter gener som skiller mellom kreft og normalt lungevev og sammenlignet disse genene «metylering nivåer med sine uttrykk nivåer. I tillegg har vi utført
i silico
funksjonell og interaksjonsanalyse av ulikt denaturert gener ved hjelp av IPA-programvare. Lineær regresjon ble brukt for å finne gener relatert til røyking, og Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse ble utført for å identifisere den differensial metylering av gener relatert til pasientens overlevelse.
Som et resultat, vi har oppdaget 496 CPGs i 379 hypermethylated gener og 373 CPGs i 336 gener som ble hypomethylated i NSCLC. En perfekt separasjon av kontroll lunge vevsprøver fra NSCLC prøvene ble ikke innhentet, som en normal lunge prøve gruppert sammen med kreftprøver og seks kreftprøver (ett i replikere) viste metylering mønstre noe som ligner svulsten frie lungevevet. Siden vi brukte ikke-dissekert tumorprøver, kan dette funnet å være i det minste delvis forårsaket av den forvirrende innvirkning av ikke-neoplastisk vev er tilstede i disse prøvene. Patologisk undersøkelse av NSCLC-prøvene med DNA-metylering profiler tilsvarende til de normale lungeprøver viste enten lav tumor-innhold (10 til 30%) eller en meget heterogen sammensetning av tumorceller i prøvene. Disse co-clustering kreftprøver og kreftfrie lunge prøver ble derfor ekskludert fra videre analyser.
Vårt første mål var å identifisere gener som er involvert i tidlige hendelser i tumor-spesifikke metylering. Som et resultat av vår screening avdekket noen kjente metylering markører, hvorav noen har tumor suppressor aktivitet:
CDKN2A
,
MGMT
,
GATA4
,
HOXA7
,
HOXA9
,
RUNX3
,
SFRP1
. De fleste av de identifiserte gener, er nye metylering markører for NSCLC, selv om noen av disse har blitt beskrevet som metylert i andre kreftformer.
LGALS12
er en kandidat tumor suppressor som er i stand til å arrestere cellesyklusen og hemme spredning av flere kreftcellelinjer [15]. I brystkreft, har
LGALS12
blitt funnet nedregulert i ondartet vev [16].
Det andre målet med vår studie var å korrelere metylering nivå endringer med genuttrykk data. Ved hjelp av Pearsons analyse, var vi i stand til å finne den forventede invers korrelasjon mellom metylering nivåer og genekspresjon verdier for 378 av 869 CpG nettsteder (43,5%). De høyeste invers korrelasjonsverdier mellom hypermethylated CPGs og uttrykk verdier ble funnet for
AGER plakater (-0,78),
Epor plakater (-0,65) og
AQP1 plakater (-0,63) gener. Gjennomsnittlig avstand fra TSS av omvendt korrelerte gener var -65 bp (range -1498, 917 bp) sammenlignet med -158 bp (range -1474, 818 bp) av positivt korrelert CPGs (p-verdi 0,02, studenter t-test). Utvalget av CPGs er trolig påvirket av det faktum at Illumina er infinium HumanMethylation27 microarray dekker CPGs som ligger hovedsakelig i nærheten av promoter regioner og ikke i genet kroppen eller 3’UTR. Aquaporin 1 (
AQP1
) har blitt rapportert å være hypermethylated og nedregulert i NSCLC [17].
AGER
, som koder for en reseptor av immunglobulin super, har blitt rapportert å bli nedregulert i NSCLC [18]. De høyeste invers korrelasjon verdier for hypomethylated CpG steder og uttrykk verdier ble funnet for
MB plakater (-0,63),
ADA plakater (-0,60) og
MAGEA6 plakater (-0,60) gener. Myoglobin (
MB
) er assosiert med tumorprogresjon og bidrar til å overvinne hypoksi i kreftceller [19]. Hypermethylation og /eller nedregulering av noen av de genene som er identifisert i vår studie (f.eks
ALDH1A2
,
HOXA5
,
MT1E
,
SOX17
) har blitt rapportert i andre krefttyper [20], [21], [22], [23], men ennå ikke i lungekreft. Det er en hypotese at
RASSF1
fungerer som en tumor suppressor i lungekreft progresjon [24]. Blant de hypomethylated og oppregulert gener, de hyppigst rapporterte genet var
SERPINB5 plakater (Maspin). Overekspresjon av
SERPINB5
har vært assosiert med kreft progresjon og en dårlig prognose i lungekreft [25].
Vi kan anta at gener med en invers korrelasjon har en høyere sannsynlighet for å bli regulert av metylering . Men mange gener sannsynligvis bli metylert tilfeldig under kreftutvikling, og dette ikke nødvendigvis har en stabil tilstand effekt på genuttrykk nivåer.
Når det gjelder ulike histologiske gruppene, var vi i stand til å finne en invers korrelasjon mellom ulikt denaturert CpG nettsteder og genekspresjon verdier for 337 780 CpG nettsteder (43,2%). De høyeste invers korrelasjonsverdiene var for
ACOX2 plakater (-0,75),
ARSE plakater (-0,70) og
SLC39A4 plakater (-0,68), som ikke har vært forbundet med NSCLC histologiske subtyper før. Av de omvendt korrelerte gener, har det blitt rapportert at
PIGR
,
MUC1 Hotell og
FOLR1
er nedregulert i SCC i forhold til AC [26], [27], [ ,,,0],28], som er konsistent med våre resultater.
Analyse ved hjelp av IPA programvare avslørte at de dominerende funksjonene til differensielt denaturert genene var celle-til-celle signalisering og samhandling, DNA replikasjon og reparasjon, cellevekst og spredning, celledød, cancer, inflammatorisk respons, etc. en rekke genfunksjoner, så som cellevekst, proliferasjon og celledød, er direkte involvert i kreftutvikling, men immunsystemet spiller også en viktig rolle i å bekjempe kreftceller. Det er også allment kjent at manglene i trasé av DNA-reparasjon og skadekontroll er ansvarlig for de fleste eller alle kreft hos mennesker. Etter blant annet de kjente indirekte relasjoner, den mest fremtredende genet nettverk avslørt var relatert til
TNF plakater (figur S5).
TNF
har en dobbel rolle i tumorbiologi. Det er et cytokin med kjente anticancer egenskaper, men kan også fremme kreftutvikling og progresjon [29]. Hypomethylated gener i
TNF
nettverk var cytokiner (
CCI3, CCI4, CCL7, CCL8, CCL22, IL21, IL17A, EBI3
) som kan enten stimulere eller hemme tumorvekst og progresjon.
TNF
nettverket omfatter også den velkjente potent antiapoptotic genet
BCL2
, som også ble stort sett hypomethylated i våre NSCLC prøvene.
ALDH1A3 plakater (aldehyd dehydrogenase en familie, medlem A3) indirekte regulert av
TNF
spiller en rolle i avgiftning av aldehyder generert av alkohol metabolisme og lipidperoksidasjon. Hypometylering av dette genet var knyttet til en dårligere prognose i vår studie kohort (figur S6).
Vi fant at
TP73
hadde tre forskjellig denaturert CPGs, hvorav to ble hypomethylated i tumorvev og ligger i nærheten av TSS av sine kortere isoformer. Den hypermethylated CpG var plassert oppstrøms for TSS av full-lengde mRNA isoformen. Vi målte uttrykk for ulike isoformer ved hjelp av qPCR analyse, men fant ingen statistisk signifikante forskjeller (p-verdi 0,36, paret t-test) i tumorprøver, selv på lang isoform ble uttrykt på et noe lavere nivå enn den korte isoform . Vi utførte en Kaplan-Meier overlevelsestest for CpG områder, som vi delte sine metylering verdier inn i 3 grupper: lav (0-0,25), medium (0,25 til 0,75) og høy (0,75 til 1). Som et resultat, har vi funnet 10 CPGs i 10 gener hvis metylering nivået er forskjellig i forskjellige overlevelsesgrupper (figur 4).
UGT1A7
er et enzym som er involvert i metabolismen av (pre) karsinogener stede i tobakksrøyk. Precarcinogens og deres metabolitter antas å spille en viktig rolle i kreftutvikling av tobakksrøken-relatert kreft [30]. Det har vist seg at polymorfismer i UGT1A7 genet er assosiert med lungecancer, hvilket antyder at disse polymorfismene redusere enzymatisk aktivitet [31]. Et høyt metylering nivå kan også påvirke
UGT1A7
aktivitet og føre til en dårlig prognose for NSCLC pasienter.
CYP1A1 plakater (hører til cytokrom P450 super) katalyserer mange reaksjoner som er involvert i legemiddelmetabolismen, også konvertering av polysykliske aromatiske hydrokarboner i reaktive metabolitter og detoxifications av miljøkreftfremkallende. Det har vist seg at
er CYP1A1
hypermethylated i lungekreft prøvene i forhold til normal lungeprøver, og dette var forbundet med redusert mRNA nivåer [32]. I vår studie var høyere metylering nivåer forbundet med dårlig overlevelse av lungekreftpasienter som støtter hypotesen om at
CYP1A1
kan ha beskyttende rolle i kreft progresjon. Andre gener som finnes i overlevelsesanalyse har ikke vært reporter for å være involvert i lungekreftpasienter overlevelse.
Ved hjelp av en annen type overlevelsesanalyse, hvor den differensielle metylering analyse ble utført ved å kombinere Cox proporsjonal fareanalyse og Wilcoxon rang-sum test, var vi i stand til å analysere 12 pasienter med en overlevelse på mindre enn 24 måneder og 15 pasienter som overlevde 60 måneder eller mer etter operasjonen. Denne analyse av de forskjellige overlevelses grupper åpenbares 15 differensielt denaturert gener.
RTEL1
, regulator av telomer-forlengelse helicase ett, synes å være det mest funksjonelt interessant en av disse. Dette er en ATP-avhengig DNA-helikase er nødvendig for å undertrykke upassende homolog rekombinasjon, for derved å spille en sentral rolle i DNA-reparasjon og vedlikehold av genomisk stabilitet.
RTEL1
ble funnet å være hypermethylated i vår dårlig overlevelse gruppe.
Sammenligning av ikke-røykere (n = 3, 6,4%) med røykere (n = 44, 93,6%), fire forskjellig metylert CpG-nettsteder relatert til tre gener, hypermethylated i ikke-røykere gruppe ble funnet:
CXorf38, MTHFD2 Hotell og
TLL2
. Manglende statistisk signifikant forskjell i metylering nivåer mellom de ulike nivåene av tobakksrøyking kan indikere en dårlig pålitelighet av pack-års data innhentet.
MTHFD2
har vist seg å ha en høyere ekspresjon i røykere, favoriserer rask cellevekst. [33].
TLL2
er en sinkavhengig metallprotease. Uttrykk for metalloproteinaser er nødvendig for celletransformasjon, og dette korrelerer med tumorprogresjon [34].
Ved å sammenligne genom endringer i DNA metylering av normale og lungekreftceller, var vi i stand til å få innsikt i kompleksiteten av metyleringen program som kreves for cellene til å bli fullt ut ondartet. Som et resultat, har vi funnet et panel av gener som skiller NSCLC-celler fra tilstøtende normale lungeceller og også squamous cell carcinoma fra adenokarsinom. Analysen viste et sett av differensielt metylerte CpG områder som synes å regulere genekspresjon og et annet sett som hadde påvirket overlevelsen av pasientene. Disse nylig identifiserte metylering markører er kandidater for videre molekylære screening av NSCLC. For å bekrefte disse markørene av NSCLC kreftutvikling, er flere studier og valideringer nødvendig. Fra resultatene av vårt arbeid og fra tidligere funn, kan vi anta at endret DNA metylering er en tidlig hendelse i NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Etikk Committee for Human studier, Universitetet i Tartu, har godkjent studien og en skriftlig tillatelse er innhentet fra forsøkspersonene.
Prøver
Vi analyserte Union for International Cancer Control (UICC) stadium i NSCLC prøver [35] fra 48 pasienter og makroskopisk kreftfrie «normale» lunge kontrollprøver fra 18 pasienter. Alle prøvene var blitt isolert under lungekirurgi ved Tartu universitetssykehus, Estland. Pasientene med adenokarsinom (n = 6, 12,5%) og dens subtype bronchioloalveolar karsinom (n = 10, 20,8%) ble analysert som en gruppe (n = 16, 33,3%). De resterende 32 (66,7%) av de analyserte pasientene hadde squamous cell carcinoma. Aldersspennet i studiegruppen var 41-80 år (gjennomsnittsalder hos menn n = 40, 66,2 år og hos kvinner n = 8, 65,5 år) (tabell S3). Pasientene hadde ikke gjennomgått noen preoperativ kjemoterapi eller strålebehandling.
På kirurgi, vevsprøver av passende størrelse (1-2 cm
3) ble kuttet fra tumorous og morfologisk tumor-fri lungevevet. En halvdel av hver prøve ble fiksert i formalin og anvendt for patologisk undersøkelse. Den andre halvdel av hver prøve ble hurtigfrosset og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Kontrollprøver ble tatt på et sted fjernt fra den fjernede tumor og bekreftet å være tumorfrie ved den samme patolog.
DNA ekstraksjon og Bisulfite Modifikasjon
DNA ble ekstrahert fra 50 mg tumor og matchende tumor-free lungevev med Dneasy® Blood Tissue Kit (Qiagen GmbH., Hilden, Tyskland) og med den Nucleospin® Tissue Kit (Macherey-Nagel GmbH., Duren, Tyskland). DNA utbytte og renhet ble bestemt ved hjelp av NanoDrop® ND1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Fra hver prøve, 500 ng av genomisk DNA var bisulfite endres ved hjelp av EZ DNA Metylering ™ Kit (Zymo Research, Orange, CA) i henhold til produsentens anbefalinger.
Metylering Validering av Sanger-sekvense
for metylering chip validering 11 gener ble valgt, fem av disse var gener fra overlevelsesanalyse og de resterende seks var gener som skilte mellom kreft og normalt vev (Primere som brukes i studien viste i tabell S4). Primere for sulfitt-behandlet DNA PCR ble utformet ved hjelp MethPrimer [36]. En 20 ul PCR ble utført i 80 mM Tris-HCl (pH 9,4-9,5), 20 mM (NH4) 2SO4, 0,02% Tween-20 PCR-buffer, 3 mM MgCl2, 1X Betain, 0,25 mM dNTP-blanding, 2 enheter av Hot-start Taq-polymerase, 50 pmol av den fremre primer, 50 pmol av den reverse primer og 20 ng av bisulfitt-behandlede genomisk DNA. PCR sykkelforholdene var 95 ° C 15 min for enzymaktivering, 95 ° C 30 sek, 62 ° C 45 sek, 72 ° C 120 sek for 17 sykluser, touchdown ved -0,5 ° C for hver syklus og 95 ° C 30 sek, 52 ° C 30 sek, 72 ° C 120 sek for 21 sykluser. Sekvensering ble gjort som en tjeneste av Core Facility estiske Biocenter. Vi analyserte sekvense spor med Mutation Surveyor programvare (Softgenetics, State College, PA, USA) og R statistisk databehandling programvare (https://www.r-project.org/).
RNA Utvinning og Gene Expression Analysis
Detaljert beskrivelse av RNA-ekstraksjon og genekspresjonsanalyser prosessen er gitt i den siste papir [14].
10 gener og åtte prøveparene (tumor og tilstøtende normal prøve) ble anvendt for å validere microarray data. For kvantitativ RT-PCR (qPCR), ble cDNA syntetisert fra 700 ng av total RNA bruker First Strand cDNA Synthesis kit (Fermentas, Vilnius, Litauen) og oligo dT primere i henhold til produsentens protokoll. Tre eksemplarer qPCR reaksjoner ble utført i 384-brønns plater ved hjelp SYBR Grønn ROX mix (ABGene, Epsom, Storbritannia eller Fermentas, Vilnius, Litauen) og ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California). Data ble analysert ved hjelp av SDS 2.2.2 (Applied Biosystems) og R statistisk databehandling programvare (https://www.r-project.org/).
Den geometriske bety uttrykk for to referansegener (
ESD Hotell og
S18RNA
) ble brukt som referanse. Expression ganger endring mellom normal og tumorprøve ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Pearson korrelasjon analyser ble brukt for å vurdere samsvar mellom fold endringer identifisert ved QRT-PCR og matrise eksperimenter.
I tillegg ble QRT-PCR benyttes for å bestemme
TP73
uttrykk nivå. Primere som brukes til
TP73
qPCR presiseringer er listet opp i tabell S5.
DNA Metylering Analyse
Metylering analyse ble utført ved hjelp av Infinium® HumanMethylation27 RevB BeadChips (Illumina Inc.). Analysen dekker 27,578 CPGs i 14,495 gener som ligger hovedsakelig i CpG øyer i proksimale promoter regioner, mellom 1,5 kb oppstrøms og 1 kb nedstrøms av transkripsjonsstartsider (TSS). En CpG øy i denne analysen er definert som en nukleotidsekvens av (1) 200 bp eller mer i lengde, (2) 50% eller mer i GC-prosent, og (3) 0,60 eller større i et forhold på observerte CpG områder spissen forventede CpG steder i regionen [10]. Den HumanMethylation27 beadchips også dekke CpG områder i de regulatoriske regioner av 1.000 kjente kreftgener, 150 differensielt denaturert gener i ulike kreftformer og 110 miRNA gener.
