Abstract
Nylig har tradisjonell kinesisk medisin og medisinske urter tiltrukket flere oppmerksomhet verden over for sin anti-tumor effekt . Celastrol og Triptolide, to aktive komponenter hentet fra kinesisk urt
Tripterygium wilfordii
Hook F (kjent som lei gong Teng eller Thunder of God Vine), har vist anti-tumor effekter. Celastrol ble identifisert som en naturlig 26 s proteasominhibitor som fremmer celle apoptose og hemmer tumorvekst. Effekten og mekanismen for Triptolide på prostatakreft (PCA) er ikke godt undersøkt. Her viste vi at Triptolide, mer potent enn Celastrol, hemmet cellevekst og indusert celledød i LNCaP og PC-3 cellelinjer. Triptolide også vesentlig hemmet xenopodet PC-3-tumorvekst i nakne mus. Videre Triptolide indusert PCa celle apoptose gjennom caspases aktivering og PARP cleavage. Ubalanse mellom SUMOylation og deSUMOylation ble rapportert å spille en viktig rolle ved PCA progresjon. SUMO-spesifikke protease 1 (SENP1) ble antatt å være en potensiell markør og terapeutiske målet for PCa. Viktigere, observerte vi at Triptolide nedregulert SENP1 uttrykk i både mRNA og proteinnivåer i doseavhengig og tidsavhengig oppførsel, noe som resulterer i en forbedret cellulær SUMOylation i PCA celler. I mellomtiden, redusert Triptolide AR og c-Jun uttrykk på lignende oppførsel, og undertrykt AR og c-Jun transkripsjon aktivitet. Videre knockdown eller ektopisk SENP1, c-Jun og AR uttrykk i PCA celler hemmet Triptolide anti-PCA effekter. Tatt sammen, våre data tyder på at Triptolide er en naturlig forbindelse med potensiell terapeutisk verdi for PCa. Sin antitumoraktivitet kan tilbakeføres til mekanismer som involverer nedregulering av SENP1 som gjenoppretter SUMOylation og deSUMOyaltion balanse og negativ regulering av AR og c-Jun uttrykk som hemmer AR og c-Jun-formidlet transkripsjon inn PCa.
Citation: Huang W, Han T, Chai C, Yang Y, Zheng Y, Zhou P, et al. (2012) Triptolide Hemmer spredning av prostata kreft celler og nedregulerer SUMO-Specific Protease en Expression. PLoS ONE 7 (5): e37693. doi: 10,1371 /journal.pone.0037693
Redaktør: Matthew Bogyo, Stanford University, USA
mottatt: 19 april 2011; Godkjent: 26 april 2012; Publisert: May 30, 2012 |
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Forestry Public Welfare Industry Research Project (201204603), Program for New Century gode talenter i Universitets (NCET-08-0467) og 100 talenter Program i Shaanxi-provinsen i Kina til Ming Lei. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer, selv om to medforfattere er fra et kommersielt selskap (Bio-farmasøytiske Corporation) som har bidratt noen reagenser eller analyseverktøy for de involverte i denne artikkelen eksperimenter. Selskapet har heller ingen finansielle eller ikke-finansielle konkurrerende interesser eksisterer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Den jevne økningen i forekomst og dødelighet av kreft oppfordrer forskere til å gjøre store anstrengelser på å søke etter nye anti-tumor legemidler eller behandlinger. Hentet forbindelser fra naturlige urter, for eksempel Taxol, har vært mye brukt i kreftbehandling. Tradisjonell kinesisk medisin lover en viktig og nyttig alternativ kreftbehandling. Mange aktive forbindelser utvunnet fra kinesiske urter har vist anti-tumor effekt. Triptolide og Celastrol, to aktive komponenter hentet fra kinesisk urt
Tripterygium wilfordii
Hook F (kjent som lei gong Teng eller Thunder of God Vine) som brukes ved leddgikt terapi, har vist anti-tumor effekt og apoptoseinduksjon [ ,,,0],1], [2]. Celastrol har blitt identifisert som en naturlig proteasominhibitor som forårsaker akkumulering av ubiquitinmolekyler og proteasomer substrater IkB-a, Bax, og P27. Celastrol induserer også apoptose i PCA celler og krymper xenopodet svulst i mus [1]. Triptolide er en diterpen lakton med potente immunosuppressive effekter og anti-tumor egenskaper i forskjellige krefttyper, inkludert melanom [2], brystkreft [3], bukspyttkjertelkreft [4], prostatakreft (PCA) [5] og andre. Triptolide induserer celleapoptose via inhibering av HSP70 i kreft i bukspyttkjertelen celler [4], [6], og avbryter IL6R-JAK /STAT banen i colon cancerceller [7]. I humane anaplastiske thyroid karsinomceller, Triptolide reduserer ekspresjon av NF-kappa B-målgener cyklin D1, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og urokinase-type plasminogenaktivator [8]. Triptolide virker enten uavhengig av eller delvis avhengig på p53 for å hemme fast stoff xenopodet tumorer vekst hos mus [9], [10]. Men effekten og molekylære mekanismen av Triptolide på PCa er mindre studert.
SUMOylation er en roman ubiquitin-like post-translasjonell modifikasjon. Fire forskjellige SUMO proteiner, SUMO-en, SUMO-2, SUMO-3 og SUMO-4, er blitt identifisert [11]. I likhet med ubiquitinering, SUMOyaltion omfatter en serie enzymatiske prosesser. Den modne SUMO aktiveres ved konjugering til E1 enzym (SAE1 /SAE2), overført til E2 enzym (Ubc9) og ligert til det spesifikke lysinresten av målproteinene ved en E3 enzym [11]. SUMOylation modulerer flere celle biologiske prosesser som atom transport, cellesyklus, kromatin remodellering, transkripsjonen regulering, DNA-reparasjon, og endring av proteiner ubiquitinering og degradering [12]. Rikelig med bevis har vist at SUMOylation er involvert i utvikling av menneskelige sykdommer, inkludert kreft.
SUMOylation er en reversibel prosess. De konjugerte SUMO molekylene kan spaltes ved SUMO-spesifikke proteaser (SENPs). Seks SENP proteiner har blitt identifisert som deSUMOylate target proteiner på forskjellige måter. SENP1 og SENP2 kan fjerne alle 3 sumos fra target proteiner, mens andre SENPs viser spesifisitet for SUMO-2 og SUMO-3 [13]. DeSUMOylation har vist seg å innebære i det menneskelige sykdommer progresjon [14] som PCa [15] og brystkreft [16]. Tidligere Cheng et al [15] rapporterte at deSUMOylation spiller en viktig rolle i utviklingen av PCa. De fant ut at SENP1 var over-uttrykt i humane PCA prøver, men ikke i normale menneskelige prostata celler. siRNA hemming av SENP1 redusert PCa celler vekst. I tillegg er deres første resultatene
in vivo
i transgene mus viste at over-uttrykk for SENP1 fører til utvikling av prostata intraepitelial neoplasi (PIN) i tidlig alder. Videre SENP1 øker markant aktiviteten av AR-avhengig transkripsjon av deSUMOylation av HDAC1 [17] og c-Jun-avhengig transkripsjon av deSUMOylating den CRD1 domenet av p300 [18], som alle er involvert i tumordannelse av PCa. Samlet er disse dataene antyder SENP1 spille en viktig rolle ved PCA progresjon og kan være en roman PCa markør og terapi mål.
I denne studien har vi vist at Triptolide betydelig hemmet PCa celleproliferasjon
in vitro
og xenopodet PC-tre tumorprogresjon
in vivo
, Triptolide også indusert apoptose i PCA celler. Den anti-tumor effekt av Triptolide var mer potent enn Celastrol. I mellomtiden har vi funnet Triptolide signifikant nedregulert den SENP1 uttrykk i både mRNA og proteinnivåer, noe som resulterer i en forbedret cellulær SUMOylation i PCA celler. Videre Triptolide også negativt regulert AR og c-Jun uttrykk og undertrykt AR og c-Jun transkripsjon. Totalt sett, våre eksperimentelle resultater tyder på at Triptolide er et naturlig potensial sammensatt for PCa terapi.
Resultater
Triptolide betydelig hemmet PCa celleproliferasjon
in vitro
både Triptolide (fig. 1A) og Celastrol (fig. 1B) tilhører terpener og er to aktive komponenter ekstrahert fra kinesisk urt
Tripterygium wilfordii
Hook F [1], [19]. Celastrol, som en potent proteasominhibitor, inhiberer PCa celleproliferasjon og induserer celleapoptose [1]. Triptolide er blitt rapportert å undertrykke celledeling i mange typer kreft, men dens effekt på PCA og målmolekylene er ikke blitt klart undersøkt. For å bestemme den anti-tumor aktivitet av Triptolide på PCA-celler og sammenligne med Celastrol, utførte vi vekstkurve analyse og cellelevedyktigheten analyse ved bruk av to PCA-cellelinjer, LNCaP (androgen-avhengige) og PC-3-celler (androgen-uavhengig). Vi bekreftet at både Triptolide og Celastrol forårsaket signifikant hemming av spredning i LNCaP og PC-3 celler. I vekstkurven analysen, Triptolide vesentlig hemmet proliferasjonen av PCA-celler selv ved doser på 5 nM i LNCaP-celler (fig. 1C) og 10 nM i PC-3-celler (fig. 1E). I motsetning til dette, Celastrol bare undertrykkes PCa-celler vekst ved høye doser, for eksempel 1 uM i LNCaP-celler (fig. 1D) og 0,5 uM i PC-3-celle (fig. 1F). Disse resultatene viste at Triptolide effektivt kan undertrykke PCa celleproliferasjon. For ytterligere å bestemme den cytotoksiske effekten av Triptolide på PCa celle og sammenligne med Celastrol, gjennomførte vi celleviabilitet analyse ved bruk av MTT metode. Begge PCA cellelinjer ble behandlet med brede doser av Triptolide eller Celastrol, fra 0.01 uM til 5 uM, i 48 timer. Som vist på figur 1G, ved lav dose (for eksempel 0,02 pM), ble Triptolide tilstrekkelig til å drepe majoritets LNCaP-celler, men gjenværende andel av levedyktige celler opprettholdt selv i nærvær av høyere konsentrasjoner av Triptolide. Det var i kontrast til den doseavhengig cytotoksisk effekt av Celastrol. Imidlertid var nødvendig for en mye høyere dose av Celastrol for å oppnå en lignende cytotoksisk effekt med 0,02 pM Triptolide. Lignende mønster ble observert i celleviabilitet assay for PC-3-celler (fig. 1 H). For å kvantifisere effekten av to forbindelser på PCa celle, beregnet vi IC
50 verdi i henhold til cellenes levedyktighet data. Triptolide hadde en mye lavere IC
50-verdier for begge cellelinjer sammenlignet med Celastrol (tabell 1). Disse data viste at Triptolide er et effektivt middel for å hemme PCa celle proliferasjon og for å indusere celledød.
(A) og (B) Den kjemiske strukturen til Triptolide (A) og Celastrol (B), respektivt. (C), (D), (E) og (F) PCA-celler ble behandlet med angitte doser av Triptolide eller Celastrol, ble levedyktige celler tellet daglig i 6 dager. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og data som er vist er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter. * Angir P 0,05 (i forhold til kontroll). (C) Virkning av Triptolide på LNCaP-celler. (D) Virkning av Celastrol på LNCaP-celler. (E) Effekt av Triptolide på PC-3-celler. (F) Effekt av Celastrol på PC-3-celler. (G) og (H) PCA Cellene ble behandlet med den angitte konsentrasjon av Triptolide eller Celastrol og cellene levedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyse. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og data som er vist er gjennomsnitt ± SD av fire uavhengige eksperimenter. (G) Effekt av Triptolide og Celastrol på LNCaP-celler. (H) Effekt av Triptolide og Celastrol på PC-3 celler.
Triptolide indusert apoptose i PCA celler
in vitro
Vi neste vurdert om Triptolide- og Celastrol-indusert celledød tilsvarte en apoptotisk respons. LnCap og PC-3-celler ble behandlet med 1 pM Triptolide og Celastrol i 24 timer, henholdsvis, farget med fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert annexin V (AV) og 50 ug /ml propidiumjodid (PI), og deretter analysert ved fluorescens mikroskopi og ved flowcytometri. Den samtidige deteksjon av fosfatidylserin eksternalisering og tap av membranintegritet med AV-FITC og PI, henholdsvis, diskriminerer mellom begynnelsen av apoptose (AV +), sen apoptose til slutt fører til sekundær nekrose (AV + /PI +) og primær nekrose (PI +). Som vist i figur 2A og figur 2B, behandling med Triptolide og Celastrol resulterte i en høyere andel av celler med positiv AV-og /eller PI farging. Strømningscytometrisk analyse viste at behandling med Triptolide og Celastrol forårsaket henholdsvis 40% og 30% av LNCaP-celler til å være AV + /PI-, mens bare 6% av bærer (DMSO)-behandlede celler viste en apoptotisk respons. De to forbindelser som hadde forholdsvis moderat effekt til å indusere apoptose i PC-3-celler, 8,77% og 15,2%, respektivt, sammenlignet med 4% i kjøretøy (DMSO)-behandlede celler (Fig. 2C og S1 fig.). Resultatene viste at både Triptolide og Celastrol indusert apoptose i PCA celler. I tillegg, LNCaP-celler var mer følsomme overfor Triptolide og Celastrol enn PC-3-celler. Det har blitt rapportert at Triptolide induserer apoptose gjennom caspase kaskade [4] – [6]. For ytterligere å avgjøre om caspase er involvert i Triptolide-indusert apoptose i PCA celler, vi undersøkt status for caspase-3 i PCA celler behandlet med ulike doser Triptolide eller Celastrol i 24 timer eller med en mikrometer Triptolide og Celastrol for ønsket tid. Aktivering av caspases-3 ble overvåket av Western blot hjelp av en polyklonale antistoff som gjenkjenner både procaspase-3 og dets aktive cleavage fragmenter, p17 og p12. Som vist i figur 2D-2E, ble spaltingen av procaspase-3 forbedret i Triptolide-behandlede LNCaP-celler, og til en mindre grad, i Celastrol-behandlede LNCaP-celler. Bare meget lave nivåer av kaspase-3 fragmenter var detekterbare i Celastrol eller Triptolide-behandlede PC-3-celler. Deretter fulgte status av kjerne enzymet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) som er en av de viktigste cleavage målene for Caspase-3. PARP-spaltning ble forbedret i Triptolide-behandlede LNCaP-celler, og til en mindre grad, i Celastrol-behandlede LNCaP-celler (fig. 2F). Igjen, lavere nivåer av PARP-fragmenter ble påvist i Celastrol eller Triptolide-behandlede PC-3-celler (fig. 2G). Til sammen er disse data viste at Triptolide, og til en mindre grad, Celastrol, indusere apoptose i PCA-celler assosiert med aktivering av kaspase-3 og spalting av PARP.
(A) og (B) Fluorescensmikroskopi observasjon av Triptolide- og Celastrol- indusert apoptose i LNCaP (A) og PC-3-celler (B). Etter behandling med 1 uM Celastrol eller Triptolide i 24 timer, LNCaP og PC-3-celler ble inkubert med AV-FITC (grønn) og PI (rød). Representant lyse felt og fluorescerende Bildene vises. (C) Strømningscytometrisk deteksjon av apoptose i LNCaP og PC-3-celler behandlet som ovenfor. Prosent av intakte celler (AV- /PI-), tidlige apoptotiske celler (AV + /PI-), sent apoptotiske /nekrotiske celler (AV + /PI +) og nekrotiske celler (AV- /PI +) er presentert. (D) og (E) Western blot-analyse av caspase-3-protein i Triptolide- eller Celastrol behandlede LNCaP (D) og PC-3 (E) celler. Celler ble behandlet med den angitte konsentrasjon av Triptolide eller Celastrol i 24 timer og underkastet analyse. Uspaltede caspase-3 og spaltede produkter er angitt. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (F) og (G) Western blot-analyse av PARP og kaspase-3-proteiner i Triptolide- eller Celastrol behandlede LNCaP (F) og PC-3 (G) celler. Cellene ble behandlet med 1 mikrometer Triptolide eller Celastrol for ønsket tid. Uspaltede PARP og caspase-3 og deres spaltede produkter er angitt. α-tubulin ble brukt som en lasting kontroll.
Triptolide trykt xenopodet PC-tre tumorvekst
in vivo
Vi observerte at Triptolide kan hemme PCa celleproliferasjon og indusere celle apoptose
in vitro
. For å bestemme effekten av Triptolide
in vivo
, gjennomførte vi xenograft studien. PC-3-celler ble implantert subkutant i nakne mus. Når svulstene ble følbar (~ 100 mm
3), ble musene behandlet intraperitonneally med enten et kjøretøy kontroll eller Triptolide på 0,4 mg /kg daglig i 15 dager. Tumorstørrelser og kroppsvekten ble målt hver tredje dag. Som vist i figur 3, vil volumet (Fig. 3A) og vekt (fig. 3C) av xenograft tumorer som ble behandlet med Triptolide var betydelig mindre enn de i kontrollgruppen (fig. 3D), noe som indikerer at Triptolide har potent anti-tumor virkning
in vivo
. I mellomtiden var det ingen signifikant forskjell i kroppsvekt mellom de behandlede og kontrollgruppen (Fig. 3B), hvilket antyder at administrerte dose av Triptolide har ingen signifikant toksisitet for mus.
PC-3-celler (2 x 10
6 per mus) ble injisert inn i 5 uker gamle nakne mus. Når faste tumorer vokste til ca. 100 mm
3, ble musene behandlet intraperitonneally med enten en bærerkontroll eller Triptolide ved 0,4 mg /kg daglig i 15 dager. Tumorstørrelser og kroppsvekten ble målt hver tredje dag. (A) Virkning av Triptolide på xenograft tumorvolum. (B) Virkning av Triptolide på nakne mus kroppsvekt. (C) Virkning av Triptolide på xenograft tumorvekt. . (D) Bilde av xenograft tumor behandles med eller uten Triptolide * viser P . 0,05 (sammenlignet med kontrollgruppen)
Triptolide nedregulert SENP1 uttrykk i PCA celler
Siden Triptolide hemmet PCa celleproliferasjon og induserte celler apoptose
in vitro
, og undertrykt xenopodet tumorvekst
in vivo
, var vi interessert i mekanismene bak disse anti-tumor effekter. Tidligere studier har vist at SENP1 er over-uttrykt i PCA celler og svulster prøver [15]. SENP1 over-ekspresjon i transgene mus som fremmer utviklingen av maligne lesjoner i prostatakjertelen [15]. Disse dataene antyder at over-uttrykk for SENP1 formidler PCa utvikling og SENP1 kan være et potensielt mål for PCa terapi.
For å undersøke om Triptolide regulerer SENP1 uttrykk, det første vi analysert SENP1 mRNA nivå ved real-time PCR i LNCaP og PC-3-celler behandlet med forskjellige doser av Triptolide eller Celastrol i 24 timer, eller behandlet med 0,1 uM Triptolide eller Celastrol til ønskede tider. Som vist i figur 4A og 4B, Triptolide signifikant redusert SENP1 mRNA-nivåer i både LNCaP og PC-3-celler på en doseavhengig og tidsavhengige oppførsel. I mellomtiden, Celastrol også redusert SENP1 mRNA nivå etter en kort behandling ved lave doser. I motsetning til dette, ved høye doser og med lengre behandlingstid, Celastrol forbedret SENP1 mRNA-nivå i begge behandlede PCA cellelinjer. For å evaluere effekten av Triptolide-indusert nedregulering av SENP1 uttrykk, bestemt vi dosen av Triptolide nødvendig for å fremkalle 50% reduksjon i SENP1 mRNA (IC
50). Både LnCap og PC-3-celler ble behandlet med mer enn 6 doser Triptolide i 24 timer, som vist i figur 4C, Triptolide effektivt induserte reduksjonen i SENP1 mRNA nivå med IC
50 verdi 0,07579 uM og 0,07071 uM for LNCaP og PC -3 celler henholdsvis. Vi målte videre SENP1 proteinnivået i PCA celler behandlet med Triptolide eller Celastrol. Triptolide var i stand til å redusere SENP1 proteinnivå i begge doseavhengig (fig. 4D, 4E) og tidsavhengig (fig. 4F) oppførsel. I motsetning til dette ble Celastrol ikke i betydelig grad redusere SENP1 proteinnivået i behandlede PCA-celler. Disse resultatene er i samsvar med våre QRT-PCR resultater og viser at Triptolide undertrykker SENP1 uttrykk i PCA celler både mRNA og proteinnivåer.
(A) Triptolide redusert SENP1 mRNA nivå i både LNCaP og PC-3 celler i en doseavhengig måte. Celler ble behandlet med angitte doser av Triptolide eller Celastrol i 24 timer før analyse. QRT-PCR ble utført ved anvendelse av spesifikke primere for SENP1 og β-aktin (anvendt som en intern kontroll). (B) Triptolide redusert SENP1 mRNA-nivå i både LNCaP og PC-3-celler i en tidsavhengig måte. Celler ble behandlet med 0,1 uM Triptolide eller Celastrol for angitte tidspunkter ble SENP1 og p-aktin mRNA-nivåer bestemt ved QRT-PCR. (C) Effekt av Triptolide på SENP1 mRNA nivå i PCA celler. IC
50 ble vist som beregnet av Prism 5.04. (D) og (E) Triptolide redusert SENP1 proteinnivå i LNCaP (D) og PC-3 (E) på en doseavhengig måte. Celler ble behandlet med angitte doser av Triptolide eller Celastrol i 24 timer før Western blot-analyse. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (F) Triptolide redusert SENP1 proteinnivået i PCA-celler i en tidsavhengig måte. PC-3-celler ble behandlet med 1 pM Triptolide til angitt tid før Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (G) Triptolide forbedret cellulær SUMOylation i PC-3 celler. PC-3-celler ble behandlet med 1 pM Triptolide eller Celastrol i 24 timer før Western blot-analyse ved bruk av SUMO-1-antistoff. NEM ble brukt som en positiv kontroll for en SUMO proteasehemmer.
SENP1 spiller en viktig rolle i SUMOylation prosesser. Som en isopeptidase, deconjugates SENP1 SUMO fra SUMOylated protein. En redusert SENP1 uttrykk i Triptolide-behandlede PCA celler vil resultere i en forbedret cellulær SUMOylation. For å bekrefte denne forventningen, celle SUMOylation nivået i PC-3 celler behandlet med 1 mikrometer Triptolide eller Celastrol i 24 timer ble oppdaget av Western blot hjelp SUMO-1 antistoff. Celler uten behandling, men lysert i lyseringsbuffer i nærvær av 20 mM N-etylmaleimid (NEM), en potent inhibitor av deubiquitinating enzymer og av SUMO hydrolase-aktivitet ble det anvendt en positiv kontroll [20]. Som vist på figur 4G, sammenlignet med kontroll, Triptolide behandling betydelig forbedret total SUMOylation nivå. Interessant, Celastrol også forbedret total SUMOylation nivå, men med mindre effektivitet i forhold til Triptolide, noe som kan resultere fra sin proteasome undertrykkelse aktivitet. Det ble rapportert at SUMOylation av noen proteiner, for eksempel HIF1 [12] og PML [21], fremmer disse proteiner ubiquitin-avhengig nedbrytning. Som et proteasominhibitor kunne Celastrol undertrykke degradering av disse SUMOylated proteiner og indusere deres akkumulering. For å bekrefte dette resultatet, utførte vi tilsvarende eksperimenter med en annen SUMO-1 monoklonalt antistoff. Western blot Resultatene viste at nivåene av SUMO-1 heterodimerer ble øket i Triptolide behandlede prøver (fig. S2A, S2B). Vi fant også at nivået av SUMO-en monomer ble redusert i Triptolide behandlet prøvene (Fig. S2C). Dette kan skyldes enten nedregulert SENP1 uttrykk, eller økningen av SUMO-1 heterodimerer. Samlet sett er i stand til å negativt regulere SENP1 uttrykk på både mRNA og proteinnivåer, noe som resulterer i en forbedret celle SUMOylation nivå i PCA celler Triptolide.
Triptolide trykkes androgen reseptor (AR) uttrykk i LNCaP celler
AR spiller en viktig rolle i normal prostata utvikling og vedlikehold, og i prostata cancer progresjon. Celastrol ble rapportert å undertrykke AR-ekspresjon i LNCaP-celler [1]. Vi reiste spørsmål om Triptolide hemmer AR uttrykk og AR-mediert transkripsjon i PCA celler. Vi analyserte AR mRNA nivå i LNCaP celler behandlet med ulike doser av Triptolide og Celastrol i 24 timer eller med 0,1 mikrometer Triptolide og Celastrol for ønsket tid ved real-time PCR. Som vist i figur 5A og 5B, Triptolide betydelig redusert AR mRNA-nivå i doseavhengig og tidsavhengige oppførsel. Vi videre analysert AR proteinnivået i LNCaP celle behandlet med Triptolide, med Celastrol-behandlede celler som positiv kontroll. Som vist på figur 5C og 5D, Triptolide redusert AR-protein ekspresjon i de samme oppførsel som mRNA-nivå. Siden AR funksjoner gjennom binding til androgen-respons-elementer (Ares) i promotorområdet av målgener og regulerer disse androgen responsgener transkripsjon å indusere celleproliferasjon [22], kan Triptolide-indusert undertrykkelse av AR uttrykk hemme AR-mediert transkripsjon. For å bekrefte denne hypotesen, uttrykk for flere AR er rettet mot gener i AR-positive LNCaP celler behandlet med ulike doser av Triptolide i 24 timer ble oppdaget av QRT-PCR (Fig. 5E). Uttrykket av Ptil, BARD1, Cdk1, Cdk2 og FKBP51, kjent for å være positivt regulert av AR, ble faktisk undertrykt. Disse dataene antyder at Triptolide hemmet AR transkripsjon aktivitet ved å undertrykke AR uttrykk. I tillegg til de AR målgener, prostataspesifikt antigen (PSA) er en viktig biologisk markør for den kliniske diagnose av human prostatakreft [23], [24]. Derfor har vi oppdaget at ytterligere PSA proteinnivå i LNCaP cellelysat og kulturmediet ved kjemiluminescens immunoassay (clia). PSA-proteinnivået i LNCaP-celler og som utskilles i mediet ble redusert etter en pM Triptolide behandling (fig. 5F), mens den samme konsentrasjon av Celastrol viste mindre suppressiv effekt på PSA. Samlet indikerer disse resultater at Triptolide undertrykker AR ekspresjon og induserer AR-mediert transkripsjon hemming.
(A) Triptolide redusert AR mRNA-nivå i LNCaP-celler på en doseavhengig måte. LNCaP-celler ble behandlet med angitte doser av Triptolide i 24 timer før analyse. QRT-PCR ble utført ved anvendelse av spesifikke primere for AR og β-aktin. (B) Triptolide redusert AR mRNA-nivå i LNCaP-celler i en tidsavhengig måte. LNCaP-celler ble behandlet med 0,1 uM Triptolide for angitte tidspunkter før analyse. (C) Triptolide og Celastrol redusert AR proteinnivået i LNCaP-celler på en doseavhengig måte. LNCaP-celler ble behandlet med angitte doser av Triptolide eller Celastrol i 24 timer før Western blot-analyse. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (D) AR Triptolide redusert proteinnivået i LNCaP-celler i en tidsavhengig måte. LNCaP-celler ble behandlet med 0,1 uM Triptolide for angitte ganger før Western blot-analyse. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (E) Triptolide redusert AR målgener uttrykk i LNCaP celler. LNCaP-celler ble behandlet med angitte doser av Triptolide til 24 timer før QRT-PCR-analyse ved hjelp av respektive spesifikke primere. (F) Triptolide hemmet PSA proteinnivå i LNCaP-celler. LNCaP-celler ble behandlet med Triptolide eller Celastrol i 24 timer eller 48 timer. Alikvoter av medium og cellelyse fra de behandlede celler ble samlet opp, og det totale PSA-nivået ble målt ved clia.
Triptolide nedregulert c-Jun-ekspresjon i PCA-celler
c oncoprotein -Jun som ofte er over-uttrykt i cancerceller er involvert i transformasjonen PCa [25]. c-Jun er en viktig komponent i transkripsjonsfaktor AP-1 [26], [27]. I tillegg c-Jun co-aktiverer AR transkripsjons aktiviteter, og SENP1 undertrykker c-Jun uttrykk [18]. For å avgjøre om Triptolide regulerer c-Jun uttrykk, behandlet vi PCA celler med forskjellige doser Triptolide eller Celastrol for 24 timer, eller med 0,1 mikrometer Triptolide eller Celastrol for ønsket tid. Som vist i figur 6A-6D, c-Jun uttrykk, på mRNA og proteinnivå, ble undertrykt ved Triptolide i doseavhengig og tidsavhengige oppførsel. I motsetning til dette, Celastrol hadde ingen virkning på c-Jun uttrykk. For ytterligere å studere effekten av Triptolide på aktiviteten av c-Jun, analyserte vi c-Jun målgener uttrykk ved QRT-PCR. c-Jun målgener Cyclin A2, syklin D1, ETV1 og p21, som er kjent for å være oppregulert ved c-Jun ble undertrykket etter Triptolide behandling (fig. 6F). Disse data indikerer at Triptolide undertrykker c-Jun ekspresjon på mRNA og proteinnivå og bra resultater i c-Jun mediert transkripsjon hemming.
(A) Triptolide nedsatt c-Jun-mRNA-nivå i LNCaP og PC-3-celler i en dose-avhengig måte. Celler ble behandlet med den angitte dose av Triptolide i 24 timer før RNA-ekstrahering og QRT-PCR ved å bruke spesifikke primere for c-Jun og β-aktin. (B) Triptolide nedsatt c-Jun-mRNA-nivå i LNCaP og PC-3-celler i en tidsavhengig måte. Cellene ble behandlet med 0,1 mikrometer Triptolide for angitt tid før RNA ekstraksjon og QRT-PCR. (C) og (D) Triptolide nedsatt c-Jun proteinnivå i LNCaP (C) og PC-3 (D) celler på en doseavhengig måte. Celler ble behandlet med den angitte dose av Triptolide eller Celastrol i 24 timer før Western blot-analyse. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (E) Triptolide nedsatt c-Jun proteinnivået i LNCaP-celler i en tidsavhengig måte. LNCaP-celler ble behandlet med 0,1 uM Triptolide til angitt tid før Western blot-analyse. α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (F) Triptolide hemmet c-Jun målgener uttrykk i LNCaP celler. LNCaP celler ble behandlet med angitte konsentrasjon av Triptolide i 24 timer før QRT-PCR analyse av c-Jun målgener ved hjelp av respektive spesifikke primere.
Down-regulering eller over-uttrykk for SENP1, c-Jun eller AR hemmet Triptolide anti-PCA effekt
Siden vi observert at Triptolide trykt SENP1 uttrykk, forbedret mobil SUMOylation, hemmet AR og c-Jun uttrykk og undertrykt AR /c-Jun-mediert transkripsjon, spurte vi om Triptolide anti -PCa effekt avhengig SENP1, c-Jun eller AR uttrykk i LNCaP og PC-3 celler. For å besvare dette spørsmålet, det første vi slått ned SENP1, c-Jun eller AR uttrykk av spesifikke siRNA i LNCaP (med siRNA av SENP1, c-Jun eller AR) og PC-3 (med siRNA av SENP1 eller c-Jun) celler. Tjuefire timer etter siRNA transfeksjon ble cellene behandlet med 100 nM Triptolide eller bærerkontroll i 48 timer ble levedyktige celler telles deretter nummeret. Effektivitet av siRNA againt SENP1, c-Jun og AR ble evaluert av Western blot (Fig. 7C). Interessant, i fravær av Triptolide behandling, å stanse all SENP1, c-Jun eller AR i LNCaP-celler nedsatt cellulær levedyktighet (fig. 7A). Tilsvarende stanse av SENP1 eller c-Jun i PC-3 celler også redusert cellulær levedyktighet (Fig. 7B). Denne observasjonen kan tyde på at cytotoksisitet av Triptolide i PCA celler kan skyldes Triptolide-indusert nedregulering av SENP1, AR eller c-juni For å avsløre virkningen av Triptolide på SENP1, AR eller c-Jun dempede celler, introduserte vi verdien av «levedyktigheten-forholdet» som er oppnådd ved å dividere den levedyktige celletall på de Triptolide-behandlede gruppe med den til kontrollgruppen gruppen uten Triptolide-behandling. Interessant, knockdown av SENP1, c-Jun eller AR viste seg å øke celler levedyktigheten forhold i henhold til Triptolide behandling (Fig. 7A, 7B), noe som tyder på høyere Triptolide motstand. Vi sjekket videre effekten av SENP1, c-Jun eller AR over-uttrykk på Triptolide anti-PCA effekt. PCA celler ble transfektert eller co-transfektert med SENP1, c-Jun og AR ekspresjonsplasmider (Fig. 7F). Et irrelevant protein EGFP ble anvendt som en negativ kontroll og en Triptolide bindende protein XPB ble anvendt som en positiv kontroll. 48 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med Triptolide for en annen 48 timer og levedyktige celler antall ble tellet. Ektopisk ekspresjon av disse proteinene ble undersøkt ved hjelp av Western blot (Fig. 7F). Som vist på fig. 7D-7E, ektopisk uttrykk for SENP1, c-Jun eller AR økt betydelig PCa celler levedyktighet forholdet etter Triptolide behandling, noe som indikerer at redde disse tre Triptolie ned regulerende proteiner uttrykk kan hemme Triptolide celle toksisitet. Videre, co-uttrykk av disse proteinene er tillagt høyere celler levedyktighet forhold enn respektive individuelle uttrykk, noe som tyder på at alle disse proteinene er involvert i Triptolide cytotoxity.
