Abstract
Bakgrunn
metastaser er den hyppigste årsaken til behandlingssvikt og død i tykk- og endetarmskreft. Tidlig påvisning av svulster og metastaser er avgjørende for å bedre behandlingsstrategier og pasient utfall. Utvikling av pålitelige biomarkører og enkle tester rutinemessig som gjelder i klinikken for deteksjon, prognostication, og terapi overvåking er av spesiell interesse. Vi har nylig identifisert romanen genet metastaser-Associated i Colon Cancer 1 (MACC1), en viktig regulator av HGF /Met-veien. MACC1 er en sterk prognostisk biomarkør for tykktarmskreft metastaser og tillater identifisering av høyrisiko fag i tidlige stadier, da bestemmes i pasientenes primærsvulster. For å overvinne begrensning av et begrenset antall molekylære analyser i svulstvev, etablering av en ikke-invasiv blodprøve for tidlig identifisering av høyrisikokreftpasienter, for overvåking sykdomsforløp og behandling respons er sterkt nødvendig.
metodikk /Principal Funn
for første gang, beskriver vi en ikke-invasiv test for kvantifisering av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i blodet på mer enn 300 pasienter med kolorektal kreft. MACC1 transkripsjonsnivåer er økt i alle sykdoms stadier av kreftpasienter i forhold til kreftfrie frivillige. Høyeste MACC1 nivåer ble bestemt hos personer med metastaser (alle P 0,05). Viktigere, høye MACC1 nivåer korrelerer med ugunstig overlevelse (P 0,0001). Kombinere MACC1 med sirkulerende transkripsjoner av metastase genet S100A4, en transkripsjons mål av Wnt /β-catenin-bane, forbedrer overlevelse prediksjon for nydiagnostiserte kreftpasienter.
Konklusjon /Betydning
Denne blod -basert assay for å sirkulere MACC1 transkripter, som kan bli kvantifisert på en rutinemessig basis, er klinisk anvendelig for diagnose, prognose og terapeutisk kontroll av kreftpasienter. Her viser vi den diagnostiske og prognostiske verdien av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i pasientens plasma for metastasering og overlevelse. Siden MACC1 representerer en lovende mål for anti-metastatisk behandling, kan sirkulere MACC1 transkripsjoner vise seg å være en ideell lese-out for å overvåke terapeutisk respons av fremtidige tiltak rettet mot MACC1-indusert metastaser hos kreftpasienter
Citation. Stein U , Burock S, Herrmann P, Wendler jeg, Niederstrasser M, Wernecke KD, et al. (2012) Sirkulasjons MACC1 transkripsjoner i Colorectal Cancer Patient Plasma Tippe metastaser og prognose. PLoS ONE 7 (11): e49249. doi: 10,1371 /journal.pone.0049249
Redaktør: Hassan Brim, Howard University, USA
mottatt: 02.05.2012; Godkjent: 04.10.2012; Publisert: 14.11.2012
Copyright: © 2012 Stein et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser. USA og PMS er patentinnehavere om MACC1 (tidligere 7a5 /prognostin) bestemmelse i primære svulster. Stein U, Schwabe H, Walther W, Schlag PM. Verwendung des neu-identifizierten Gens 7a5 /Prognostin (MACC1) für Tumordiagnostik und Tumortherapie. 7a5 /Prognostin og anvendelse derav for diagnostikk og terapi av tumorer. Patent JP2006-519895: 13.5.2011. Patent AU 2004259281: 12.5.2011. Patent US 7,851,168 B2: 14.12.2010. Patentsøknad CA 2526240: 2004. patentsøknad EP 008 053: 2004. patentsøknad DE 10.332.854,8: 2003. USA, PH, SB og PMS er innehavere av en patentsøknad for bruk av metastase Progressor S100A4 transkripsjoner i kroppsvæsker av tykk- og mage kreftpasienter. Stein U, Herrmann P, Burock S, Schlag PM. Bruk av metastase Progressor S100A4 transkripsjoner i kroppsvæsker av kolorektal og mage kreftpasienter. Patentsøknad PCT /EP2010 /001891: 19.3.2010 patentsøknad US 61/261017: 13.11.2009. Forfatterne bekrefter at dette ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
metastaser er den hyppigste årsaken til behandlingssvikt og død i tykk- og endetarmskreft. Tidlig påvisning av svulster og metastaser er avgjørende for å bedre behandlingsstrategier og pasient utfall. Utvikling av pålitelige biomarkører og enkle tester som er rutinemessig aktuelt i klinikken for deteksjon, prognostication, og terapi overvåking er av spesiell interesse.
Vi har nylig identifisert romanen genet metastaser-Associated i Colon Cancer 1 (MACC1) [ ,,,0],1] – [3]. MACC1 er en ny prognostisk biomarkør for tykktarmskreft metastaser og metastasering overlevelse når bestemt i pasientenes primærsvulster. MACC1 nivåer i de primære svulster ble funnet å være signifikant høyere hos kreftformer som metachronously utviklet fjernmetastaser sammenlignet med dem som ikke metastaserer innenfor en 12-års oppfølging. Den prediktive verdi av biomarkør på hvorvidt en svulst vil metastasere eller ikke var henholdsvis 74% og 80%. 5-års-overlevelse var 80% for pasienter med lav MACC1, sammenlignet med 15% for pasienter med høyt MACC1 uttrykk i deres primære svulster. MACC1 er en prediktor for kolorektal kreft metastasering uavhengig av tumorstadium, alder, kjønn, tumor infiltrasjon, lymfeknutestatus og lymfe fartøy invasjon, og tillater således identifikasjon av individer med høy risiko for metastaser i tidlige stadier [1]. Dette gjør MACC1 en viktig prognostisk gen i klinisk praksis. Videre fant vi at MACC1 fungerer en viktig regulator av HGF (hepatocytter vekstfaktor) /Met-veien, som er avgjørende i kolorektalkreft for tumorprogresjon og metastasedannelse [1], [2], [4].
Flere grupper bekreftet i mellomtiden en sammenheng med høy MACC1 uttrykk i svulsten til progresjon, metastaser, overlevelse, og terapi respons i tykk- og endetarmskreft (CRC) [5] – [9]. Rollen MACC1 som en biomarkør for kreft progresjon og overlevelse ble i mellomtiden også rapportert for andre faste kreftformer, som mage [10], lunge [11], [12], hepatocellulær [13], [14] og eggstokkreft [15 ].
Molecular analyser i svulstvev, f.eks er nødvendig for sykdomsprognose i sammenheng med metastasedannelse og overlevelse, er begrenset til et begrenset antall tilgjengelige vevsprøver. For å overvinne denne begrensningen, etablering av en ikke-invasiv MACC1 basert blodprøve for tidlig identifisering av høyrisikokreftpasienter og for overvåking av sykdomsforløpet, samt behandlingsrespons er derfor sterkt nødvendig.
Her , for første gang, har vi utviklet en ikke-invasiv assay for MACC1 transkripsjonsnivåer i plasma. Vi analyserte den diagnostiske verdien av MACC1 nivåer for påvisning av tumorer og metastaser i tykktarm og endetarm kreftpasienter, og dens prognostisk verdi for total overlevelse (overlevelse) av disse pasientene. Videre vurderte vi fordelen av å kombinere MACC1 med en ytterligere metastase genet, S100A4, for bedre prediksjon av sykdom prognose [16] -. [18]
Materialer og metoder
Mål
Den metastasefremkallende genet MACC1 er en sterk prognostisk biomarkør for tykktarmskreft metastaser og tillater identifisering av høyrisiko fag i tidlige stadier, da bestemmes i pasientenes primærsvulster. For å overvinne begrensningen av et begrenset antall av molekylære analyser i tumorvev, vi sikte på etablering av en ikke-invasiv MACC1 basert blodprøve for tidlig identifisering av høyrisikokreftpasienter og for overvåking av sykdomsforløpet.
Deltakere
For tykktarm og endetarmskreft pasientenes egenskaper se tabell 1, 2, 3. Påfølgende pasienter med tykktarms eller endetarmskreft som ble sett på Robert Rössle Cancer Hospital, Charité Universitetet Medicine Berlin, i løpet av 2006 til 2007 for innleggelse eller poliklinisk behandling og som ga sitt skriftlige samtykke til å delta i vår tumor biobank ble registrert.
Pasientdata data~~POS=HEADCOMP for histopatologisk karakterisering av svulsten (inkludert tumorinfiltrasjon , lymfeknutestatus, metastaser, gradering, lymfekar infiltrasjon, blodårer infiltrasjon, restsvulst), for behandling og overlevelse var tilgjengelig fra svulsten bredden av Charité Comprehensive Cancer Center. Histologisk svulst staging ble utført av rutine patologi. Eksklusjonskriterier var andre kreftformer i løpet av historien eller oppfølging. Vi analyserte 312 blodprøver av tykktarmen (n = 151) og rektal (n = 161) kreftpasienter (tabellene 1, 2, 3).
Blodprøver ble tatt ved dag for diagnosen fra nylig diagnostiserte pasienter med en primær svulst uten eller med synkrone metastaser eller fra pasienter som utviklet metastaser metachronously etter R0-reseksjon av primærtumor. Unntak: Pasienter med nydiagnostisert lokalavansert endetarmskreft, som fikk neoadjuvant kort kurs stråling eller langsiktig radiochemotherapy (n = 16). Her ble blodprøver tatt etter neoadjuvant behandling av den primære tumor. For pasienter som får kort kurs stråling, intervallet mellom slutten av behandlingen og blodtaking var 3 til 6 dager. Vi fant ikke signifikant forskjellige MACC1 transkripsjonsnivåer mellom behandlet (n = 16) og de ikke-behandlede endetarmskreftpasienter (n = 23).
Blodprøver fra kohort av oppfølgings pasienter ble tatt utelukkende i løpet av oppfølgingsperioden (median 975 og 1280 dager etter primærdiagnose, median 807 og 853 dager oppfølging etter blod tar for tykktarms- og endetarmskreft, henholdsvis)
plasma~~POS=TRUNC kontrollene som stammer fra to uavhengige kohorter. frivillige (n = 54). Rekruttering av de frivillige ble støttet av Klaus Sperber, Medisinsk utøveren, Berlin, og av Ursula Plöckinger, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlin. Alle frivillige må være tumor-fri og uten en historie med onkologiske sykdommer. Vi fant ikke signifikant forskjellige MACC1 nivåer med hensyn til kjønn, alder, eller mellom de to kohortene.
Nylig diagnostisert med kolorektal kreft pasienter med primær svulst med eller uten synkrone metastaser ble gruppert på grunn av sin kronologiske eksamen i et test-sett (n = 36) og en validering-sett (n = 35) for bestemmelse av den diagnostiske verdien av sirkulerende MACC1 transkripsjoner (tabell 4).
Plasma Forberedelse
først undersøkte vi optimale forhold for blodtaking, lagring og plasma separasjon. Etter opptak av blod friske frivillige (n = 12), ble EDTA-blod holdt ved romtemperatur eller ved 4 ° C. Plasma-separasjon ble utført enten umiddelbart, eller 7, 24, 48 og 72 timer etter blodtaking (10 analyser pr frivillig). RNA ble isolert og MACC1-spesifikke kvantitative sanntids RT-PCR ble utført i duplikat (Fig. 1A). MACC1 transkripsjonsnivåer tjente som leses ut. Vi fant ingen endringer av MACC1 nivåer når plasma separasjon ble utført i løpet av de første 24 timene (enten avkjølte eller oppbevares i romtemperatur). Basert på disse funnene, ble plasma separert fra avkjølte EDTA-blod på samme dag i løpet av 7 timer etter blodtaking. Prosedyren for separering plasma ble som tidligere beskrevet [18]. Blindet prøver, hverken tykktarm eller endetarm, og heller ikke stadium av sykdommen ble beskrevet under analysen, ble lagret ved -80 ° C.
A. Plasma separasjonsbetingelser for bestemmelse av sirkulerende MACC1 transkripsjoner. Plasma separering av prøver fra tumor-frie frivillige (n = 12) ble gjort umiddelbart, 7, 24, 48 og 72 timer etter inntak av blod, enten fra blodprøver ble holdt ved 4 ° C eller ved romtemperatur. Deretter plasmaet ble dannet i løpet av de første 7 timene fra 4 ° C avkjølt blod. B. MACC1 transkripsjoner i plasma tumorfrie frivillige (n = 54). Ingen forskjell i MACC1 transkripsjonsnivåer ble funnet i to uavhengig analysert kullene av tumor-frie frivillige (n = 34 og n = 20, henholdsvis). C. MACC1 transkripsjoner i plasma hos alle pasienter med kolorektal kreft (n = 312). Alle pasientkullene som bærer tykktarms, tykktarm (n = 151) eller rektalt (n = 161) kreft uttrykt betydelig høyere MACC1 transkripsjonsnivåer enn kreftfrie frivillige (
P
0,001 for alle sammenligninger).
RNA og kvantitativ real-time RT-PCR
Isolering av total RNA ble utført som tidligere beskrevet [18]. Kvantitativ sanntids RT-PCR ble utført ved 30 sek 95 ° C, 45 x (10 sek 95 ° C, 10 sek 62 ° C, 10 s 72 ° C), og som smelter kurve 40 ° C til 95 ° C, etter ved hjelp av LightCycler (DNA Master hybridiseringsprober kit, Roche Diagnostics) som tidligere beskrevet [1]. De følgende primere og prober ble anvendt for å amplifisere et 136 bp MACC1-spesifikk PCR-produkt: forover primer 5′-TTCTTTTGATTCCTCCGGTGA-3 «, revers primer 5′-ACTCTGATGGGCATGTGCTG-3′, FITC-probe 5»-GCAGACTTCCTCAAGAAATTCTGGAAGATCTA-3 «, LCRed640- probe 5»-AGTGTTTCAGAACTTCTGGACATTTTAGACGA-3 «(synteser av primere og prober: BioTeZ og TIB MolBiol, Berlin, Tyskland). Kalibratoren cDNA ble ansatt i serielle fortynninger samtidig i hvert løp, avledet fra cellelinjer SW620. Autentisering av cellelinjen ble utført av kort tandem repeat (STR) genotyping (DSMZ Braunschweig, Tyskland). STR genotype var i overensstemmelse med den publiserte genotype for denne cellelinjen (ATCC, CCL-227). S100A4-spesifikke kvantitative sanntids RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet [18]. mRNA-ekspresjon av en blodprøve er gitt som prosent av mRNA-ekspresjon av et definert kalibrator prøve, som ble satt til 100%. Hver prøve ble kjørt i duplikat, midlene er avbildet.
Etikk
Alle blodprøver fra pasienter og kreftfrie frivillige ble oppnådd med informert skriftlig samtykke i henhold til den internasjonale konferansen om harmonisering og med godkjenning av lokale IRB.
statistiske metoder
Forskjeller mellom grupper i form av MACC1 transkripsjonsnivåer i plasma ble testet ved å bruke ikke-parametrisk Wilcoxon-Mann-Whitney tester (avhengig av distribusjon av normalitet): kreftfrie frivillige kontra pasienter med primære svulster uten og med synkrone metastaser, til pasienter med metachronous metastaser, og for å følge opp pasienter; pasienter med svulster kontra de med tumorer og metastaser. Ved små utvalg, større forskjeller i utvalgsstørrelser, store men ubalansert grupper, datasett som inneholder bånd, eller sparsom data, ble tester utført i en eksakt versjon. Vi vurderte
P
0,05 å være betydelig. Alle numeriske beregninger ble utført med SPSS, versjon 18.
For å definere den diagnostiske verdien av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i plasma, sensitivitet og spesifisitet ble beregnet med en fire bord for kolorektal kreft (test- og validering-sett), tykktarm og endetarmskreftpasienter, som nylig ble diagnostisert med en primær svulst uten eller med synkrone metastaser i forhold til blodprøver av 54 kreftfrie frivillige. I samsvar med deres kronologiske undersøkelse og innledende pasienter som tar blod ble gruppert i et test-sett og valideringssettet. Vi begynte med en test-sett av nydiagnostiserte CRC pasienter (n = 36), bestemmes den optimale cut-off verdi av MACC1 (sensitivitet 75%, spesifisitet 76%), og brukt denne cut-off verdi for validering-sett CRC-pasienter (n = 35). Sensitivitet og spesifisitet var 77% og 76%, respektivt. Når man kombinerer alle nydiagnostiserte CRC pasienter, sensitivitet og spesifisitet var 76%. Når du analyserer tykktarm og endetarm kreftpasienter separat, følsomhet var 77% for tykktarmskreft og 76% for endetarmskreft. Spesifisitet var 89% for tykktarmskreft og 76% for kreft i endetarmen, henholdsvis.
For å overleve analyse av nylig diagnostisert og av alle CRC-pasienter, ble Kaplan Meier-kurver i kombinasjon med log rank test benyttet. Disse CRC pasienter ble inkludert i denne analysen hvor begge merkene, MACC1 og S100A4, kunne bestemmes (n = 294). Cut-off verdi av MACC1 og cut-off verdi av S100A4 var medianen av de undersøkte gruppene (hoveddiagnose eller alle pasienter), henholdsvis. Beregninger ble utført med SPSS, versjon 18.
Resultater
Kvantifisering av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i Human Plasma
utgangspunktet identifisert optimale forhold for plasma behandling og MACC1 transkripsjon kvantifisering etter blod tar. Plasma-separering og etterfølgende MACC1 analyser ble utført umiddelbart eller 7, 24, 48 og 72 timer etter blod tatt fra tumor-frie frivillige (n = 12; 10 aliquoter pr frivillig), enten 4 ° C avkjølt eller hensatt ved romtemperatur ( fig. 1A). Økte MACC1 nivåer ble målt på grunn av hemolyse etter 48 og 72 timer etter å ta blod. For å bestemme basale nivåer av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i tumorfrie frivillige og pasienter med kolorektal kreft, vi deretter separert plasma fra 4 ° C Kjølte blodprøver i løpet av de første 7 timer etter blodtaking.
Sirkulasjons MACC1 transkripsjoner i Plasma av tumor-fri frivillige
Vi analyserte basale MACC1 nivåer av kreftfrie frivillige i to uavhengige gruppene (n = 34 og n = 20, henholdsvis; fig. 1B). MACC1 transkripsjoner ble påvist i alle prøver, uten signifikante forskjeller mellom de to kohortene. Alle kreftfrie frivillige ble kombinert for senere analyser (median 0,224 MACC1 mRNA uttrykk /% kalibrator).
Sirkulasjons MACC1 transkripsjoner i Plasma diskriminere Tumor-fri Frivillige og pasienter med kolorektal kreft
Neste, vi analysert MACC1 nivåer i plasma fra kolon (n = 151) og rektal (n = 161) kreftpasienter (pasientenes egenskaper: Bord 1, 2, 3). For å evaluere den diagnostiske verdien av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i plasma sammenlignet vi nylig diagnostisert CRC pasienter med primær svulst med eller uten synkrone metastaser (n = 71) med tumorfrie frivillige (n = 54) og beregnet sensitivitet og spesifisitet med en fire bord. Vi begynte med en test-sett av nydiagnostiserte CRC pasienter (n = 36; sensitivitet 75%, spesifisitet 76%), og anvendt den beregnede optimale cut-off verdi for valideringssettet nydiagnostiserte CRC pasienter (n = 35; sensitivitet 77%, spesifisitet 76%). Når man kombinerer alle CRC-pasienter nydiagnostiserte, sensitivitet og spesifisitet var 76% (tabell 4). Når du analyserer tykktarm og endetarmskreftpasienter separat, sensitiviteter var 77% og 76%, og særegen var 89% og 76%, henholdsvis. Dermed MACC1 transkripsjonsnivåer i plasma støtter identifisering av enkeltpersoner som bærer tykktarm og endetarmskreft.
Vi oppdaget MACC1 transkripsjoner i plasma av alle kreftpasienter. Vi fant betydelig høyere MACC1 nivåer i tykktarmen, endetarmen, og kolorektal (kombinert) kreftpasienter i forhold til kreftfrie individer (alle
P
0,001 Fig. 1C). Vi observerte ingen signifikante variasjoner av MACC1 nivåer på grunn av alder, kjønn, eller mellom tumor stadium I, II og III.
Høy Sirkulasjons MACC1 transkripsjonsnivåer i plasma av spredning pasienter med kolorektal kreft
Å vurdere relevansen av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i plasma i forhold til metastasedannelse, ble pasientene klassifisert etter sykdom scenen: pasienter med primær svulst uten synkrone metastaser (trinn i-III, n = 51 for tykktarms, n = 12 for tykktarm, og n = 39 for endetarmskreftpasienter); pasienter med en primær tumor og synkrone metastase (stadium IV; n = 20 for tykktarms, n = 10 for tykktarm, og n = 10 for endetarmskreftpasienter); og personer med metachronous metastaser etter R0-reseksjon av den primære tumor (n = 11 for kolorektal, n = 4 til kolon, og n = 7 for rektale kreftpasienter) (tabellene 1, 2, 3). Blod ble tatt på dag for diagnosen. I tillegg har vi også inkludert oppfølgings pasienter (n = 230 for kolorektal, n = 125 for kolon, og n = 105 for rektale kreftpasienter; Tabellene 1, 2, 3). MACC1 nivåene var signifikant høyere i hvert stadium av sykdommen av tykktarms- og endetarmskreft, sammenlignet med tumorfrie frivillige (fig. 2A-C). Bemerkelsesverdig var tydelig økt MACC1 nivåer funnet i nylig diagnostiserte kreftpasienter med synkron metastaser (stadium IV), sammenlignet med kreftpasienter uten fjernmetastaser (trinn I-III): for kolorektal (Fig. 2A), tykktarm (Fig. 2B), og endetarmskreft (fig. 2C), median 0,937, 2,249 og 0,829 MACC1 mRNA uttrykk /% kalibrator i metastasert pasienter, sammenlignet med 0,61, 0,78 og 0,559 MACC1 mRNA uttrykk /% kalibrator hos pasienter uten fjernmetastaser (
P
= 0,006,
P
= 0,176 og
P
= 0,041 for tykktarms, tykktarm og endetarm kreftpasienter, henholdsvis). Dermed kvantitativ måling av MACC1 transkripsjoner i pasientens blod er av diagnostisk verdi i forhold til metastaser.
A, B, C. Alle kolorektal (A, n = 312), kolon (B, n = 151), og rektal (C, n = 161) kreftpasient under kohorter viste signifikant høyere sirkulerende MACC1 transkripsjonsnivåer enn kreftfrie frivillige (n = 54). Høyere MACC1 nivåer ble også funnet for kolorektal (
P
= 0,006; A) og endetarms (
P
= 0,041; C) kreftpasienter med synkrone metastaser (n = 20 og n = henholdsvis 10,) sammenlignet med pasienter uten fjernmetastaser (n = 51 og n = 39, henholdsvis). Box plot analyse, basert på kvantitativ real-time RT-PCR.
Høy Sirkulasjons MACC1 transkripsjonsnivåer i plasma fra pasienter med kolorektal kreft er assosiert med kortere overlevelse
Neste, vi evaluert prognostisk effekt av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i plasma. Vi begynte analysen av sirkulerende MACC1 nivåer med hensyn til overlevelse av nylig diagnostiserte CRC pasienter med en primær tumor med eller uten synkrone metastaser (blodprøver ble tatt på dag diagnose) (Fig. 3A). Cut-off-verdien som ble brukt var medianen av de målte MACC1 nivåer i denne pasient kohort (0.670 MACC1 mRNA uttrykk /% kalibrator). I henhold til denne cut-off, ble pasientene klassifisert som lav eller høy MACC1 uttrykkere. Interessant, de nydiagnostiserte pasienter med lave MACC1 nivåer ( cut-off) viste en signifikant lengre overlevelsestid enn pasienter med høyt MACC1 nivåer ( cut-off) (
P
= 0,003; fig. 3A). Således sirkulerende MACC1 transkripsjonsnivåer i plasma når den bestemmes ved den dagen for diagnose, er av prognostisk verdi for overlevelsen av nylig diagnostiserte pasienter.
A, B. Kaplan-Meier-analysen for nylig diagnostisert (A, n = 49) og alle (B, n = 294) CRC pasienter, basert på MACC1 alene (A, lav MACC1 n = 24, høy MACC1 n = 25, B, lav MACC1 n = 147, høy MACC1 n = 147). Nydiagnostiserte CRC pasienter (A), samt alle CRC-pasienter (B) med høye sirkulerende MACC1 transkripsjonsnivåer demonstrert kortere overlevelse sammenlignet med pasienter som viser lave MACC1 nivåer (
P
= 0,003 og
P
0,0001, henholdsvis). C, D. Kaplan-Meier-analysen for nylig diagnostisert (C, n = 49) og alle (D, n = 294) CRC-pasienter, er basert på en kombinasjon av MACC1 og S100A4. Nylig diagnostiserte CRC pasienter (C) og alle CRC-pasienter (D) ble inndelt i grupper av lave uttrykkere av begge gener (n = 13 og n = 85, henholdsvis), av pasienter med høye S100A4 nivåer (n = 25 og n = 147 , henholdsvis), fra pasienter med høye MACC1 nivåer (n = 25 og n = 147, henholdsvis), eller med høy ekspresjon av begge biomarkører (n = 14 og n = 85, henholdsvis). For nydiagnostiserte pasienter (C), ble overlevelse redusert med økende nivåer av sirkulerende transkripsjoner av S100A4, av MACC1, eller begge deler. Expression induksjon av enten MACC1 eller S100A4 eller begge biomarkører korrelert til redusert pasienter overlevelse.
Deretter ønsket vi å analysere om en prognostisk effekt av MACC1 transkripsjoner gjelder for kohort av alle CRC-pasienter, herunder oppfølging pasienter. Cut-off-verdien som ble brukt var medianen av de målte MACC1 nivåer av alle CRC-pasienter (0,518 MACC1 mRNA uttrykk /% kalibrator). Basert på denne cut-off, ble alle CRC-pasienter gruppert som lav eller høy MACC1 uttrykkere. Bemerkelsesverdig, kan vi bekrefte våre funn fra gruppen av nydiagnostiserte pasienter også for alle CRC pasienter analysert: pasienter med lav MACC1 nivåer ( cut-off) viste en signifikant lengre overlevelsestid enn pasienter med høyt MACC1 nivåer ( kutt off) (
P
0,0001, fig. 3B). Dermed nivåer av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i CRC pasient plasma er av prognostisk verdi med hensyn til pasientens overlevelse.
Kombinasjon av sirkulerende MACC1 og S100A4 transkripsjonsnivåer i plasma Forbedrer Survival Prediksjon for pasienter med kolorektal kreft
for ytterligere å forbedre prediksjon av overlevelse, la vi den metastase genet S100A4, et mål av Wnt /β-catenin-vei, til denne MACC1 analyse. Vi hadde valgt disse metastase biomarkører for kombinasjon, siden de tar mest relevante signalveier i kolorektal kreft progresjon og metastase: MACC1 – en viktig regulator av HGF /Met signalveien, og S100A4- en transkripsjons target gen av Wnt /β-catenin signalveien. Så langt, ingen kryss regulering av disse to metastaseassosierte gener – MACC1 og S100A4 – er kjent
Videre tidligere rapportert vi den diagnostiske og prognostiske verdien av S100A4 transkripsjoner i plasma [18].. Her, personer med lav S100A4 plasmanivå viste også en lengre overlevelse (fig. S1 A, B).
Vi først tok opp spørsmålet om hvorvidt kombinasjonen av både biomarkører, sirkulerende transkripsjoner av MACC1 og av S100A4 kan forbedre den prognostiske verdien av MACC1 alene i kohort av nydiagnostiserte CRC pasienter. De grenseverdier som ble brukt var medianen av de målte MACC1 nivåer i denne pasient kohort (0.670 MACC1 mRNA uttrykk /% kalibrator) samt medianen av de målte S100A4 nivåer i denne pasient kohort (0,435 S100A4 mRNA uttrykk /% kalibrator) . I henhold til disse cut-off-verdier ble pasienter klassifisert som lave uttrykkere for begge gener, for eksempel høye uttrykkere av S100A4, for eksempel høye uttrykkere av MACC1, eller så høye uttrykkere av begge gener. Pasienter som viste lave sirkulerende nivåer av MACC1 og av S100A4, hadde de lengste overlevelse ganger. Redusert overlevelse ble deretter observert hos pasienter med høye nivåer S100A4, etterfulgt av pasienter med høye nivåer MACC1. Korteste overlevelsestider ble funnet for pasienter med både biomarkører sterkt uttrykt (fig. 3C). Derfor, for nydiagnostiserte pasienter, kombinasjonen av høy MACC1 og høye S100A4 nivåer bedret overlevelse prediksjon, sammenlignet med høye MACC1 nivåer alene.
Vi vurderte deretter denne kombi MACC1 og S100A4 tilnærming med hensyn til overlevelse for alle CRC-pasienter , herunder oppfølging pasienter. De grenseverdier som ble brukt var medianen av de målte MACC1 nivåer for alle CRC-pasienter (0,518 MACC1 mRNA uttrykk /% kalibrator) samt medianen av de målte S100A4 nivåer for alle CRC-pasienter (0,421 S100A4 mRNA uttrykk /% kalibrator) . I henhold til disse cut-off-verdier, ble alle CRC pasienter klassifisert som lave uttrykkere for begge gener, for eksempel høye uttrykkere av S100A4, for eksempel høye uttrykkere av MACC1, eller så høye uttrykkere av begge gener. Som observert for nydiagnostiserte pasienter, også alle CRC-pasienter som viste lavt sirkulerende nivåer av MACC1 og av S100A4, hadde de lengste overlevelse ganger. Expression induksjon av enten MACC1 eller S100A4 eller begge biomarkører korrelert til redusert pasienter overlevelse (Fig. 3D).
I tillegg har vi også sammenlignet overlevelsen av pasienter med lave nivåer av MACC1 og av S100A4 eller med bare én markør (enten MACC1 eller S100A4) økte med overlevelsen av pasienter som viste både MACC1 og S100A4 forhøyet. Vi fant en signifikant kortere overlevelse for pasienter med høyt plasmanivå av både biomarkører. Dette ble observert for kohort av nydiagnostiserte pasienter (
P
0,0001, Fig. S2A) samt for alle CRC pasienter analysert (
P
= 0,001, Fig. S2B ).
Diskusjoner
Her er vi rapportere utviklingen av den første blodbaserte analysen for metastasering-induserende gen MACC1, som er en prognostisk biomarkør for tykktarmskreft metastaser samt for tumorprogresjon og overlevelse i en rekke faste cancere. Denne analyse for sirkulering MACC1 transkripter, som kan bli kvantifisert på en rutinemessig basis, er klinisk anvendelig for diagnose, prognose og terapeutisk kontroll av kreftpasienter. Nivåer av sirkulerende MACC1 transkripsjoner er betydelig høyere hos kreftpasienter i forhold til kreftfrie frivillige. Bemerkelsesverdig, ble høyeste nivåene av sirkulerende MACC1 transkripsjoner bestemt i personer med metastaser, demonstrere diagnostiske verdien av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i pasientens plasma med hensyn til metastasedannelse. Viktigst, høy MACC1 nivåer – prospektivt bestemt -. Korrelerer med ugunstig overlevelse av pasientene som understreker den prognostiske verdien av sirkulerende MACC1 transkripsjoner
Påvisning av cellefritt mRNA i blodet som «flytende biopsier» lar sanntids overvåking av sykdom fremgang, prognose og terapeutisk respons [19]. Tallrike studier beskriver karakter påvisning av sirkulerende cellefrie RNA i plasma og serum av pasienter som lider av en rekke faste cancere, inkludert skjoldbruskkjertelen, lunge, mage, bryst og livmorhalskreft, og dets anvendelse for prognose av sykdomsforløpet [20] – [29]. Stabilitet av sirkulerende cellefri RNA sikres ved exosomes (mikropartikler, mikrovesikler, multivesicles) som beskytter det mot nedbrytning [30], [31]. Spesielt for sirkulering av plasma RNA fra kolon kreftpasienter det er rapportert at denne cellefri RNA er begrenset i mRNA-anrikede vesikkel-lignende strukturer [32]. Flere sirkulerende transkripter har allerede blitt rapportert å være nyttige for diagnose og prognose for kolorektal kreft; f.eks hTERT [33], β-catenin [34], tymidylatsyntase [35], og LISCH7 [36]. Spesielt CEA [37], [38], også i kombinasjon med markører som CK19, CK20, hTERT, TIMP-1, miR141 [39] – [41], er anerkjent som potensielt hjelpemiddel i tidlig deteksjon av CRC, som prognostisk markør for tilbakefall, og også som prediktiv biomarkør med hensyn til behandling respons. Teste kombinasjon av begge, CEA og MACC1 kan utkonkurrere disse funksjonene.
Våre nye funn av sirkulerende MACC1 transkripsjoner i plasma fra pasienter med kolorektal kreft for diagnose og prognose for å overleve er i tråd med de som vi rapporterte tidligere basert på kvantifisering av mRNA-ekspresjon i kolorektal kreft vev med hensyn til sykdomsprognosen [1]. Deretter flere grupper validert koblingen av høy MACC1 uttrykk i kolorektal kreft vev til avansert sykdom (f.eks [5], [7], [8]).
