Abstract
Bakgrunn
De hydroksylerte derivater av kolesterol, slik som oxysterols, spiller viktige roller i lipidmetabolismen. Spesielt har 25-Hydroxycholesterol (25HC) vært innblandet i en rekke metabolske hendelser, inkludert kolesterol homeostase og åreforkalkning. 25HC kan påvises i humant plasma etter inntak av et måltid rikt på oxysterols og følge et kosttilskudd kolesterol utfordring. I tillegg nivåene av oxysterols, inkludert 25HC, har blitt funnet å være forhøyet i hyperkolesterolemi serum.
metodikk /hovedfunnene
Her viser vi at østrogen reseptor (ER) a medierer genuttrykk endringer og vekstresponser indusert av 25HC i bryst- og eggstokk-kreftceller. Dessuten oppviser 25HC den ERα-avhengige egenskaper som 17β-østradiol (E2) til å inhibere den opp-regulering av HIF-1α og bindevev vekstfaktor ved hypoksiske forhold i kardiomyocytter og rottehjerte preparater og for å forhindre den hypoksi-indusert apoptose.
Konklusjon /Betydning
østrogen handling som utøves av 25HC kan betraktes som en ekstra faktor involvert i utviklingen av brystkreft og eggstokkreft svulster. Videre kan østrogenlignende aktivitet 25HC fremkalte i det kardiovaskulære systemet spille en rolle mot hypoksiske miljøer
Citation. Lappano R, Recchia AG, De Francesco EM, Angelone T, Cerra MC, Picard D, et al. (2011) The Cholesterol metabolitter 25-Hydroxycholesterol Aktiverer østrogenreseptor α-mediert signale i kreftceller og i cardiomyocytes. PLoS ONE 6 (1): e16631. doi: 10,1371 /journal.pone.0016631
Redaktør: Vincent LAUDET, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Frankrike
mottatt: 07.09.2010; Godkjent: 27 desember 2010; Publisert: 31 januar 2011
Copyright: © 2011 Lappano et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, prosjekt n 8925/2009.) (https://www.airc.it/) og Minis dell’Università e Ricerca SCIENTIFICA e Tecnologica (MIUR) (http: //www.istruzione.it/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den østrogen reseptor (ER) α og β hører til kjernefysisk reseptor superfamily av ligand-induserbare transkripsjonsfaktorer [1]. Bindingen av 17β-østradiol (E2) til å induserer ende kravene reseptor homodimerization og interaksjon med spesifikke østrogen-responsive elementer (eres) som befinner seg innenfor de regulatoriske regioner av målgener [2]. To separate aktiverings domener medierer den ER-avhengig transkripsjonen aktivitet: aktiveringsfunksjonen (AF) -1 lokalisert i den amino-terminale ende og den hormonavhengig AF-2 lokalisert i den ligandbindende domene (LBD) [3]. Binding av ligander til ER induserer dannelsen av en AF-2 hydrofob lomme som regulerer rekrutteringen av kofaktorer og viktigere reseptor farmakologi [4] – [5]
Tidligere resultater som ble oppnådd i begge cellekultur og dyremodeller. har angitt at ERα spiller en avgjørende rolle i å mediere virkningene av østrogen i melkekjertler utvikling og progresjon brystkreft [6] – [7]. Videre har østrogen blitt vist å forebygge vaskulær dysfunksjon og skade i en ER-avhengig måte [8] – [10], for å redusere kardiomyocytt hypertrofi [11], og til å redusere infarktstørrelse og myocyte apoptose i dyremodeller med koronar okklusjon [12] . Forskjellige mekanismer som er involvert i den beskyttende virkning som utøves av E2 i kardiomyocytter. Oksidativt stress og den påfølgende generering av reaktive oksygenarter (ROS) er antatt å utløse kardiomyocytt apoptose [13], mens evnen til E2-aktivert ER for å motvirke disse redoks-mellomproduktene er meget sannsynlig en nøkkelfaktor av generell kardioproteksjon. Den celle-respons til redusert oksygenmiljø impliserer den hypoksi-induserbar-faktor-1 (HIF-1), som regulerer ekspresjon av gener som matricellular proteinet som heter Connective Tissue Growth Factor (CTGF) som tilhører CCN familien av vekstregulatorer (
cyr61
, CTGF og
november
) [14]. Nivåene av CTGF er oppregulert i løpet av sår reparasjon [15], inflammasjon [16], fibrotiske forstyrrelser [17], tumorvekst [18] – [19] og angiogenese [18], [20]. Samle bevis har også foreslått at CTGF utøver en avgjørende rolle i hjerte fibrotiske prosesser, indikerer det som en mulig biomarkør og en potensiell kandidat for terapeutisk intervensjon [21].
Oxysterols er hydroksylerte derivater av kolesterol som spiller viktige funksjoner i lipidmetabolismen [22]. 25-Hydroxycholesterol (25HC) som er syntetisert fra kolesterol ved en spesifikk hydroksylase [23], virker som en potent inhibitor for kolesterolbiosyntese i forskjellige celletyper [24]. 25HC ble påvist i rotte plasma etter inntak av et måltid rikt på oxysterols og følge et kosttilskudd kolesterol utfordring [25]. Likeledes nivåene av oxysterols, inkludert 25HC, var høyere i hyperkolesterolemi serum sammenlignet med de som finnes i normokolesterolemiske serum [26]. Deretter mus mangelfull i oxysterol-catabolizing enzym oxysterol 7α-hydroksylase (Cyp7b) viste forhøyede konsentrasjoner av både 25HC og 27HC, tyder på en regulerende rolle utløst av Cyp7b på disse hydroksylerte kolesterolderivater [27].
I denne studien, viser vi at 25HC utløser østrogen effekt aktive ERα-mediert signale enten i bryst- og eggstokkreft celler eller i cardiomyocytes. De oppnådde resultatene ble bekreftet, i det minste delvis, i isolerte perfuserte rottehjerter og.
Materialer og metoder
Reagenser
17β-østradiol (E2), 25-Hydroxycholesterol (25HC), kobolt klorid (CoCl
2), PD98059 (PD), SB202190 (SB) og actinomycin D ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia. Eksperimentene utføres ved å bruke 25HC fra Sigma-Aldrich, Inc., Milan (Italia) ble bekreftet med 25HC kjøpt fra Forsknings Plus, Inc., Barnegat, NJ. ICI 182 780 (ICI) ble oppnådd fra Tocris Chemicals. Alle forbindelser ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO), med unntak av E2 og PD, som ble oppløst i etanol.
Cell Culture
Brystkreft MCF7 og human embryonal nyre HEK293-celler ble opprettholdt i DMEM med fenolrødt supplert med 10% FBS. Bryst SKBR3 og eggstokk-BG-1 cancerceller ble opprettholdt i RPMI1640 og DMEM, henholdsvis, uten fenol rød supplert med 10% FBS. Muse kardiomyocytt lignende cellelinje HL-1 ble vennlig levert av Dr. William C. Claycomb (Louisiana State University Medical Center, New Orleans, LA). HL-1-celler ble dyrket i henhold til den protokoll som er publisert [28] i Claycomb medium (JRH Biosciences, Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia) supplert med 10% FBS (JRH Bioscience, Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia), 100 ug /ml penicillin /streptomycin, 0,1 mM noradrenalin (Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia) og 2 mM
l
-glutamine (Invitrogen, Milano, Italia). Alle cellelinjer ble dyrket i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2. For hypoksisk stimulerings HL-1 celler ble behandlet med CoCl
2 eller dyrket i nærvær av lavt oksygenspenning (2% O
2) i en HeraCell inkubator (ThermoScientific-Heraeus, Milano, Italia). Alle cellelinjer for å bli behandlet for immunoblot og RT-PCR-analyser ble byttet til medium uten serum og fenol rød 24 timer før behandling.
transfections, luciferase analyser og gene silencing eksperimenter
Plasmider og Luciferase analyser ble tidligere beskrevet [29] – [32]. I særdeleshet har vi brukt ekspresjonsvektorer som koder for den fulle lengde ERα og ERβ formen som koder for 485-aa-proteinet [29] – [32]. Celler ble sådd ut i 10-cm skåler, holdt i serumfritt medium i 24 timer og deretter transfektert i ytterligere 24 timer før behandling med Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals, Milano, Italia) og hensiktsmessige kontroll vektorer. De SureSilencing ™ shRNA plasmider for mus HIF-1α og respektive negative kontroll plasmider (shRNA) ble kjøpt fra Superarray Biovitenskap Corporation (Frederick, MD, USA) og ble brukt i henhold til produsentens anbefalinger (Cat. KM03799P). I korthet ble cellene sådd ut i 10-cm skåler, og deretter transfektert i serumfritt medium i 24 timer før behandling med en blanding inneholdende 15μl /plate Fugene6 reagens og 5 ug /plate kontroll shRNA eller shRNA HIF-1α (shHIF-1α) plasmidet. For HIF-1α stanse, gir produsenten 4 separate kort hårnål RNA (shRNA) pre-designede sekvenser for det samme genet, pakket i 4 separate plasmid stamnett (nummerert som 1-4). I våre forsøk, et enkelt uavhengig shRNA plasmid sekvens (n.3) var tilstrekkelig til å slå av HIF-1α genekspresjon. Kontrollen shRNA er en egge kunstig sekvens som ikke samsvarer med noe menneske, mus eller rotte gen.
ERα bindingsanalyser
Evnen 25HC å konkurrere med [3H] E2 for binding til ERα ble evaluert enten i MCF7-celler, eller ved hjelp av HEK293-cellelysatene i nærvær eller fravær av to picomol av renset rekombinant, humant protein ERα innkjøpt fra PanVera, Invitrogen Srl Milano, Italia. MCF7 celler ble fratatt noen østrogen ved å holde dem i medium uten serum i 2 dager, deretter ble cellene inkubert med 1 nM [2,4,6,7-3H] E2 (89 Ci /mmol, GE Healthcare, Milano, Italia) og økende konsentrasjoner av nonlabeled E2 eller 25HC i 2 timer ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft /5% CO2. Etter fjerning av medium, ble cellene vasket med iskald PBS /0,1% metylcellulose to ganger, innhøstet ved skraping og sentrifugering og lysert med 100% etanol, 500 ul pr 60 mm skål, i 10 minutter ved romtemperatur [33]. Radioaktiviteten av ekstraktene ble målt ved væskescintillasjonstelling. Bindingsanalysen ble også utført ved anvendelse av HEK293 hele cellelysater. Celler ble strippet av enhver østrogen ved å holde dem i medium uten serum i 2 dager, og deretter lysert i 500 ul av RIPA-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40, 0,5 mM EDTA) i nærvær av en blanding av protease-inhibitorer inneholdende 1,7 mg /ml aprotinin, 1 mg /ml leupeptin, 200 mmol /liter fenylmetylsulfonylfluorid, 200 mmol /liter sodiumorthovanadate og 100 mmol /l natriumfluorid. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Bradford reagens i henhold til produsentens anbefalinger (Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italia). Like mengder av hel-proteinekstrakt ble inkubert i fravær eller nærvær av to picomol av rekombinant ERα og inkubert med 1 nM [3H] E2 og økende konsentrasjoner av umerket E2 eller 25HC i 2 timer ved 4 ° C. Bundet og frie radioligander ble separert på Sephadex G-25 PD-10 kolonner. Mengden av reseptor-bundet [3H] E2 ble bestemt ved væskescintillasjonstelling.
Chromatin immunoutfelling (chip) og Re-Chip-analyser
MCF7-celler ble dyrket i 10 cm skåler 70 -80% konfluens, skiftet til serumfritt medium i 24 timer og deretter behandlet med bærer, 10 nM E2 eller 1 uM 25HC i 1 time. Deretter ble cellene kryssbundet med 1% formaldehyd og sonikert. Supernatanter ble immunocleared med ultralydbehandlet lakse DNA /protein A agarose (Upstate Bioteknologi, Inc., Lake Placid, New York) og immunopresipitert med anti-ERα antistoff eller ikke spesifikt IgG (Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milano, Italia). Pelletene ble vasket, eluert med en buffer bestående av 1% SDS og 0,1 mol /l NaHCO3, og spaltet med proteinase K. DNA ble oppnådd ved fenol /kloroform-ekstraksjon og utfelt med etanol. En 4 mL volumet av hver prøve ble brukt som mal for å forsterke et ERE-holdig regionen ligger i pS2 promoter ved real-time PCR (Applied Biosystems, Milano, Italia). Primerne som ble anvendt var 5′-GGCCATCTCTCACTATGAATCACTTCTGC-3 «(pS2 forover) og 5′-GGCAGGCTCTGTTTGCTTAAAGAGCG-3» (pS2 omvendt). Data ble normalisert til inngangen for immunpresipitering. I Re-Chip eksperimenter, ble kompleksene eluert ved inkubering i 30 minutter i Re-IP-buffer (0,5 mM ditiotreitol, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl pH 8,1, 150 mM NaCl) og underkastet brikken prosedyre, ved hjelp av anti-SRC-en, SRC-3 og CBP antistoffer (alle kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milano, Italia).
revers transkripsjon og real-time PCR
Genekspresjon ble evaluert ved sanntids-PCR som vi tidligere beskrevet [32]. For pS2, PR, Cathepsin D, syklin A, syklin D1, HIF-1α, CTGF, FAS, SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1 og de ribosomale protein 18S, som ble anvendt som en kontroll-gen for å oppnå normaliserte verdier, primerne var: 5 «-GCCCCCCGTGAAAGAC-3′ (pS2 forover) og 5»-CGTCGAAACAGCAGCCCTTA-3 «(pS2 omvendt); 5»-GAGTTGTGAGAGCACTGGATGCT-3 «(PR forover) og 5′-CAACTGTATGTCTTGACCTGGTGAA-3′ (PR revers); 5»-CTGGATCCACCACAAGTACAACA-3 «(Cathepsin D forover) og 5′-CGAGCCATAGTGGATGTCAAAC-3′ (Cathepsin D omvendt); 5»-TGCACCCCTTAAGGATCTTCCT-3 «(cyclin A fremover) og 5′-GTGAACGCAGGCTGTTTACTGT-3′ (cyclin A bakover); 5»-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3 «(Cyclin D1 forover) og 5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′ (Cyclin D1 revers); 5»-TGCATCTCCATCTTCTACCCAAGT-3 «(HIF-1a forover) og 5′-CCGACTGTGAGTGCCACTGT-3′ (HIF-1α revers); 5»-CATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCAT-3 «(CTGF forover) og 5′-TGCAGCCAGAAAGCTCAAACT-3′ (CTGF omvendt); 5»-CGCTCGGCATGGCTATCT-3 «(FAS forover) og 5′-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3′ (FAS omvendt); 5»-CCCGGATCGTCTTTGAGAAG-3 «(SERPINF1 forover) og 5′-TCCAGAGGTGCCACAAAGCT-3′ (SERPINF1 revers); 5»-CCGTGCCAGCCTATTTCAAT -3 «(HSPA1L forover) og 5′- AGCAATCACACCTGCATCCTT-3′ (HSPA1L omvendt); 5»-GCAGCGCCATGAGATTGTG-3 «(SELENBP1 forover) og 5′-CGGATCTCCAAGGGAATAAGC-3′ (SELENBP1 omvendt), og 5»-GGCGTCCCCCAACTTCTTA-3 «(18S forover) og 5′-GGGCATCACAGACCTGTTATT-3» (18S omvendt), respektivt .
Immunoblotting
Cellelysater og immunoblottingforsøk analyser ble utført som tidligere beskrevet [32]. Antistoffene mot ERα (F-10), Cyclin D1 (M-20), CTGF (L-20), fosforylert ERK1 /2 (E-4) og ERK2 (C-14), β-actin (C-2) og β-tubulin (H-235-2) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (DBA, Milano, Italia). ERβ og HIF-1α ble kjøpt fra R D Systems, Inc. (Milano, Italia). Fosfor-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) og p38MAPK ble kjøpt fra Cell Signalering Technology, Inc. (Milano, Italia).
spredning og tunel analyser
Kvantitative spredning analysene ble utført som tidligere beskrevet [ ,,,0],32]. HL-1-cellene ble sådd ut i 2-brønners Lab-Tek® II kammers objektglass og behandlet i 18 timer. Etter fjerning av medium, ble cellene fiksert i 4% bufret paraformaldehyd (pH 7,4) i 30 min. Objektglass ble skylt to ganger i PBS, pH 7,4. En
in situ
celledød deteksjon kit (deadend ™, Fluorometrisk TUNEL System, Promega Corp, Milano, Italia) ble senere brukt til å utføre DNA 3′-hydroksyl slutten merking av TUNEL (Terminal deoksynukleotidyltransferase (TdT) – mediert dUTP Nick End-X Merking) assay som tidligere beskrevet [34]. Merking av celler ble vist å være korrelert med typiske morfologiske kriterier av apoptose. DNA ble merket i 3′-ender med fluorescein-dUTP ved inkubering ved 37 ° C med reaksjonsbuffer inneholdende TdT i et fuktet kammer i 1 time. Kjerner av celler ble farget med propidiumjodid. Etter tre vaskinger i PBS ble apoptotisk DNA-fragmentering påvises direkte ved visualisering av merket DNA ved bruk av fluorescerende mikroskop. For negativ kontroll ble lysbilder inkubert uten TdT; å skaffe positiv kontroll, ble slides behandlet med 1 ug DNAse I /ml i 10 minutter ved romtemperatur før eksponering for fluorescein dUTP og TdT.
Isolerte og perfuserte hjerte forberedelser
Alle forsøksprotokoller ble godkjent av komiteen for bruk av dyr i Farmakoterapeutisk biologi Institutt ved Universitetet i Calabria (godkjenning ID 110 /2000A). Prosedyrene som følges i studien var i samsvar med EUs standarder på omsorg og bruk av forsøksdyr og med
Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr
utgitt av det amerikanske National Institutes of Health (NIH publikasjon nr 85-23, revidert 1996). Voksne hannrotter (Wistar, 220-280g, Harlan, Udine, Italia) ble bedøvet ved i.p. injeksjon av etyl-karbamat (2 g /kg kroppsvekt). Hjertene ble deretter dissekert ut og koplet til et Langendorff-apparat for perfusjon med Krebs-Henseleit-oppløsning (KHS) bestående av (i mM) NaCI 113, KCI 4,7, NaHCO3 25, MgSO4 1,2, CaCl2 1,8, KH2PO4 1,2, glukose 11, mannitol 1,1, Na-pyruvat 5 og gasset med 95% O
2-5% CO
2 (pH 7,4, 37 ° C). KHS ble levert ved en konstant strømningshastighet på 12 ml /min. For å måle hjerteaktivitet, en vannfylt lateksballong, som er koblet til en BLPR måleren (AFI, Inc. USA), ble satt inn gjennom mitral ventil inn i venstre ventrikkel for å tillate isovolumisk sammentrekninger og for å kontinuerlig registrere mekaniske parametre. Ballongen ble progressivt fylles med vann for å oppnå en første venstre ventrikkel ende diastolisk trykk på 5 til 8 mmHg [35]. Alle hjerter ble perfusert i 15 min utjevningsperiode. Etter likevekt, hjerter (n = 3) ble randomisert til ett av følgende grupper: Gruppe 1 (kontroll): KH gasset med 95% O
2-5% CO
2; Gruppe 2: KH gasset med 95% O
2-5% CO
2 pluss 1 nM E2; Gruppe 3: KH gasset med 95% O
2-5% CO
2 pluss 100nM 25HC; Gruppe 4: KH gasset med 50% O
2-45% N
2-5% CO
2; Gruppe 5: KH gasset med 50% O
2-45% N
2-5% CO
2 pluss 1 nM E2; Gruppe 6: KH gasset med 50% O
2-45% N
2-5% CO
2 pluss 100nM 25HC
Alle hjerter ble dynket i 60 minutter for å undersøke effekten. av hver forbindelse og av de forskjellige oksygennivået i forandringene i CTGF og HIF-1α mRNA-ekspresjon. Løsningen inneholder behandlinger var nylaget før eksperimenter. Venstre ventrikulære trykk, hjertefrekvensen og den koronare strømmen ble overvåket under perfusjon protokollen. Ved slutten av perfusjoner, ble ventriklene skåret ut og umiddelbart bearbeidet for RNA-ekstraksjon.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av ANOVA etterfulgt av Newman-Keuls «testing for å bestemme forskjeller i middel. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
25HC aktiverer ERα i kreftceller
Vi begynte å vurdere om 25HC er i stand til å transactivate en transient transfektert ER reporter gen. brystkreft celler (MCF7), som uttrykker ERα og ikke ERβ som bedømt ved RT-PCR (data ikke vist). Interessant, 25HC aktivert ERα på en doseavhengig måte, men med lavere effektivitet sammenlignet med E2 (fig. 1A). Vi evaluerte neste om 25HC kunne motvirke transkripsjonsaktivering indusert av E2. MCF7-celler ble deretter behandlet samtidig med økende konsentrasjoner av både 25HC og E2, men de transkripsjonelle responser var lik de som ble oppnådd anvendt E2 alene (figur 1A.). Tvert imot, ble luciferase-aktivitet indusert ved 10 nM E2 eller 1 uM 25HC opphevet ved bruk av økende doser av ER-antagonist ICI (Fig. 1B), noe som tyder på at ERα medierer den transkripsjonelle aktivering ved eksponering for hver forbindelse. For å gi ytterligere data vedrørende evnen til å aktivere 25HC ERα og for å vurdere hvorvidt ERβ kan også svare på 25HC, vi transient transfektert ER-negativ HEK293-celler med ER rapportørgenet sammen med ekspresjonsvektoren som koder ERα eller ERβ. Av notatet, bare ERα uttrykk tillatt 1 um 25HC å indusere luciferase aktivitet, som ble avskaffet ved 10 uM ICI (Fig. 1C-D). For å gi ytterligere bevis vedrørende evne 25HC å aktivere ERα men ikke ERβ, vi slått til en helt heterologt system. I HEK293-celler, 1 uM 25HC aktivert et kimært protein som består av den DNA-bindende domene (DBD) av gjær transkripsjonsfaktor Gal4 og LBD av ERα men ikke ERβ (fig. 1E-F). Igjen ble den transaktivering av ERα opphevet ved 10 uM ICI (fig. 1E-F). For å underbygge de nevnte funnene, konstaterte vi enten 25HC kan indusere uttrykk for ERβ målgener SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1, som ble rapportert å svare på E2 behandling [36]. Ved hjelp av HEK293-celler forbigående transfektert med en ERβ ekspresjonsplasmid, ble transkripsjon av disse gener stimulert av E2, men ikke ved 25HC (fig. S1). Tatt sammen, disse resultater viser at 25HC aktiverer ERα på en selektiv måte og viser at ERα-LBD er tilstrekkelig for transkripsjonen respons.
(A) MCF7-celler ble transfektert med en ER luciferase reporter-gen sammen med den interne transfeksjon kontroll Renilla Luciferase og behandlet med økende konsentrasjoner (logaritmisk skala) av E2 og 25HC. Videre ble cellene behandlet samtidig med tilsvarende doser av hver forbindelse. De normaliserte luciferase aktivitetsverdier for celler behandlet med vehikkel (-) ble satt til 1. gangers induksjon, hvorpå aktiviteten indusert av behandling ble beregnet. (B) MCF7-celler transfektert med ER-rapportørgenet ble behandlet med 10 nM E2 eller 1 uM 25HC alene og i kombinasjon med økende konsentrasjon av ER-antagonist ICI, som angitt. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre eksperimenter utført i tre eksemplarer. (C-F) HEK293-celler ble transfektert med ER luciferase reporter-genet (EREluc) og ERα (C) eller ERβ (D) ekspresjonsplasmider, med Gal4 reportergen GK1 og GAL4 fusjonsproteinene som koder for det ligandbindende domene (LBD) av ERα (GalERα) (E) eller ERβ (GalERβ) (F) og behandlet med 10 nM E2 eller 1 uM 25HC alene og i kombinasjon med 10 uM ER-antagonist ICI, som angitt. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre forsøk utført in triplo.
På basis av resultatene oppnådd i forsøk transfeksjon, spurte vi om 25HC kunne oppføre seg som en ligand, og konkurrere med E2 for binding til ERα. I en hel cellebindingsanalyse med MCF7 celler 25HC forskyves den radiomerkede E2 på en doseavhengig måte (fig. 2A). Tilsvarende, når rekombinant ERα ble tilsatt til en HEK293-celle-lysat, som i seg selv ikke binder E2, 25HC konkurrerte effektivt mot tracer E2 (fig. 2B-C). Resultatene av disse bindingsanalyser er kompatible med ideen om at 25HC binder ERα direkte, men ytterligere forsøk vil det være nødvendig å etablere virknings utvetydig.
Figurene viser gjenværende binding av radioaktivt sporstoff i nærvær av økende konsentrasjoner av umerket E2 og 25HC i MCF7-celler (A), i HEK293-cellelysatene i nærvær (B) eller fravær av rekombinant ERα protein (C). Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± SD av triplikate prøver av tre separate forsøk. Legg merke til at mengden av sporstoff er bundet i fravær av konkurrent ble vilkårlig satt til 100%, og at de underliggende absolutte verdier varierer mellom de tre panelene.
25HC induserer rekruttering av ERα til pS2 promotersekvens i MCF7-celler
på bakgrunn av de ovennevnte resultater, evaluert vi hvorvidt 25HC kunne indusere rekruttering av ERα til målrettede ERE-inneholdende DNA region innenfor pS2 promotersekvens. Utføre en kromatin immunoprecipitation (chip) assay i MCF7 celler, 1t behandling med 1 um 25HC indusert rekruttering av ERα til PS2-arrangøren som observeres med 10 nM E2 (Fig. 3A). Dessuten, for å verifisere hvorvidt 25HC kan rekruttere ko-aktivatorer til den pS2-promoteren, utførte vi Re-chip-assay ved å bruke antistoffer mot SRC-1 og SRC-3, som hører til steroid-reseptor-ko-aktivator (SRC) familier og mot CBP ( CREB-bindende protein) [37]. Alle co-aktivatorer ble effektivt rekruttert til PS2-arrangøren utsette MCF7 celler til 10 nM E2, men 1 um 25HC viste en svak effekt (fig. 3A). Derfor, E2 og 25HC viser en annen mulighet i å rekruttere ko-aktivatorer, som bidrar til den agonistiske potens av ligander.
(A) E2 og 25HC indusere rekruttering av ERα til ERE-sete lokalisert i den pS2 promoteren sekvens i MCF7 celler. Cellene ble behandlet i 1 time med bil, E2 (10 nM) eller 25HC (1 um) og leveres til kromatin immunpresipitering prosedyren ved hjelp av anti-ERα eller uspesifikke anti-IgG antistoffer. For Re-chip analyser, anti-SRC-en, SRC-3 og CBP antistoffer ble brukt. De amplifiserte sekvenser ble evaluert ved sanntids-PCR. (B-C) evaluering av mRNA-ekspresjon av pS2, progesteronreseptor (PR), Cathepsin D, syklin A og syklin D1 til real-time PCR i MCF7 og BG-1-celler. Cellene ble behandlet for 24 timer med 10 nM E2 og 1 um 25HC. Resultatene oppnådd fra eksperimenter utført i triplikat ble normalisert for 18S ekspresjon og vist som gangers skifte av RNA-ekspresjon sammenlignet med celler behandlet med vehikkel. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittlig ± SD for tre eksperimenter utført i tre eksemplarer. (•), (°), (▪), (□) (♦) viser
p
. 0,05 for celler som får bilen (-) versus behandlinger
25HC regulerer uttrykket av ERα målgener i MCF7 og BG-1 celler
Vi har evaluert neste potensialet 25HC å regulere uttrykket av kjente ERα målgener som PS2, PR, Cathepsin D, cyclin A og syklin D1 i MCF7 bryst og BG-1 eggstokkreft celler. Som bestemt ved sanntids RT-PCR, en 24 timers eksponering til 1 uM 25HC oppregulert mRNA ekspresjon av alle gener undersøkt, i likhet med behandling med 10 nM E2 (fig. 3B-C). For ytterligere å underbygge disse funnene, undersøkte vi muligheten for 25HC til å modulere ekspresjon av ERα og syklin D1 proteinnivåer i MCF7 og BG-1 tumorceller. Til dags dato har den nedregulering av ERα med østrogen vært betraktet som et kjennetegn på reseptoraktivering [38], mens den oppregulering av Cyclin D1 av E2 er blitt omfattende rapportert [39]. Spesielt, en 24 timers eksponering for 1 um 25HC nedregulert ERα protein nivåer (Fig. 4A-B). Tvert imot, en 24 timers behandling med 1 uM 25HC oppregulert Cyclin D1 proteinekspresjon, som ble opphevet ved 10 uM ICI (fig. 4C-D). Til sammen tyder disse resultater på at 25HC er i stand til å regulere ekspresjonen av ERα målgener som E2.
immunoblot av ERα (A, B) og Cyclin D1 (C, D) fra MCF7 og BG-1-celler. Cellene ble behandlet i 24 timer med bærer (-), 10 nM E2 eller 1 uM 25HC og i nærvær av 10 uM ER-antagonist ICI, som angitt. β-actin fungerer som lasting kontroll. 25HC induserer proliferative effekter i MCF7 og BG-1-celler (E-H). -Celler ble behandlet i 5 dager med økende konsentrasjoner (logaritmisk skala) av E2 og 25HC og tellet på dag 6 (E, G). Celler ble behandlet med 10 nM E2 eller 1 uM 25HC og i kombinasjon med 10 uM ER-antagonist ICI og tellet på dag 6 (F, H). Proliferasjon av celler mottok bæremiddel var satt som 100%, hvorpå cellevekst fremkalt av behandlingene ble beregnet. Hvert datapunkt er gjennomsnittet ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (•), (°) indikerer
p
. 0,05 for celler som får bilen (-) versus behandlinger
25HC induserer proliferative effekter i MCF7 og BG-1 celler
Deretter, søkte vi å evaluere den biologiske motstykke av de ovennevnte virkninger som utøves av 25HC. Vekstmålinger utført i MCF7 og BG-1 cancerceller viste at 25HC er i stand til å indusere proliferative effekter i en doseavhengig måte (fig. 4E og 4G). Deretter ble vekst responser på 10 nM E2 og 1 uM 25HC opphevet ved 10 uM ICI (fig. 4F og 4H), noe som tyder på at ERα medierer celleproliferasjon indusert ved eksponering for begge forbindelser.
25HC etterligner virkningene av E2 imot hypoksi-indusert apoptose i cardiomyocytes
for å ytterligere evaluere østrogen egenskaper 25HC, vi slått til en helt annen modell system som HL-en cardiomyocytes [28], som uttrykker ERα og svært lave ERβ nivåer som dømmes etter RT-PCR (data ikke vist). Det har blitt rapportert at E2 beskytter cellene mot hypoksisk fornærmelse i forskjellige celle sammenhenger [40] – [42]. Derfor evaluert hvorvidt vi E2 og 25HC kunne beskytte HL-1 kardiomyocytter fra apoptose indusert ved hjelp av den kjente hypoksi-mimetiske middel CoCl
2 [43] – [44]. Bestemmelse av DNA degradering ved TUNEL assay, ca 70% av HL-1-celler resulterte positive for TUNEL-farging etter eksponering for CoCl
2 (fig. 5 og S2 fig.). Av notatet, ble andelen av apoptotiske celler betydelig redusert i nærvær av enten 10 nM E2 eller 1 um 25HC (Fig. 5 og S2 fig.). Den beskyttende effekten som utøves av begge forbindelser ble avskaffet ved hjelp 10uM ICI, som alene ikke indusere apoptose (Fig. 5 og S2 fig.). Til sammen resultatene vist indikerer at E2 og 25HC kan beskytte cardiomyocytes fra hypoksi-indusert apoptose i en ER-avhengig måte.
apoptotiske endringer ble oppdaget ved hjelp TUNEL (i grønt) og kjerner ble farget med propidiumjodid ( PI, i rødt), som angitt. Representative fotografier etter 18 timer behandling med bærer og 100 uM CoCl2, 10 nM E2, 1 uM 25HC alene, eller en kombinasjon av 100 uM CoCl2 med 10 nM E2 i nærvær eller fravær av 10 uM ICI, 100 uM CoCl2 med 1 uM 25HC i nærvær eller fravær av 10 uM ICI.
E2 og 25HC hindre hypoksi-indusert ekspresjon av HIF-1α og CTGF i cardiomyocytes
det har tidligere blitt rapportert at HIF-1α formidler CTGF uttrykk stimulert av hypoksi i forskjellige celle sammenhenger [ ,,,0],45] – [47]. Mens potensialet regulering av HIF-1α av E2 er blitt foreslått i visse modeller [48] – [49], forblir østrogen evne til å påvirke hypoksi-indusert CTGF ekspresjon i det kardiovaskulære systemet som skal undersøkes. På grunnlag av disse betraktningene, som er fast- vi at HIF-1α og CTGF er oppregulert på både mRNA og proteinnivåene i en tidsavhengig måte ved 100 uM CoCl
2 i HL-1-celler (fig. 6A, C) . Lignende responser ble observert inkubering av HL-1 celler i nærvær av lavt oksygenspenning (2% O
2) (fig. 6B, D). Deretter ble den hypoksi-indusert ekspresjon av HIF-1α og CTGF opphevet ved bruk av inhibitor for DNA-primet RNA-syntese actinomycin D (fig. S3), hvilket antyder at transkripsjonelle mekanismer er ansvarlige for oppregulering av både HIF-1α og CTGF . Da fant vi ut at ved å stanse all HIF-1α opphever CTGF induksjon observert enten ved eksponering for CoCl
2 eller hypoksiske forhold (2% O
2) (fig. 6E-F), noe som indikerer at HIF-1α medierer oppreguleringen av CTGF ved hypoksi i HL-1-celler. Deretter spurte vi om E2 og 25HC kan påvirke HIF-1α og CTGF uttrykk. Interessant nok har vi funnet at enten 10 nM E2 eller 1 uM 25HC forhindre opp-regulering av HIF-1α og CTGF enten ved CoCl
2 eller lavt oksygentrykk (2% O
2) ved begge mRNA (fig. S4) og proteinnivåer (fig. 7A-B).
