Abstract
Den molekylære anstand CCT /tric spiller en sentral rolle i å opprettholde cellulære proteostasis som det formidler folding av de store cytoskeletal proteiner tubulins og actins . CCT /Tric er også involvert i oncoproteinet cyclin E, Von Hippel-Lindau tumor suppressor protein, cyclin B og p21
ras folding som sterkt antyder at det er involvert i celledeling og tumor genesis. For å vurdere den medvirkning fra CCT /tric i tumor genese, vi kvantifisert dens ekspresjonsnivåer og aktivitet i 18 kreft, en ikke-cancer humane cellelinjer og en ikke-kreft human lever. Vi viser at uttrykket nivåer av CCT /tric i kreftcellelinjer som er høyere enn i normale celler. Men CCT /tric aktivitet ikke alltid korrelerer med sine uttrykk nivåer. Vi dokumentert derfor uttrykket nivåer av CCT /tric modulatorer og partnere PhLP3, Hop /P60, prefoldin og Hsc /Hsp70. Vår analyse viser et funksjonelt samspill mellom molekylære anstand som kan står for en presis modulering av CCT /trisk aktivitet i cellevekst gjennom endringer i den cellulære nivåer av prefoldin og /eller Hsc /p70 og CCT /tric klient protein tilgjengelighet. Vår observasjon og tilnærminger bringe ny innsikt i rollen CCT /tric-mediert proteinfolding maskiner i kreft celle utvikling
Citation. Boudiaf-Benmammar C, Cresteil T, Melki R (2013) cytosoliske Chaperonin CCT /tric og kreftcelle spredning. PLoS ONE 8 (4): e60895. doi: 10,1371 /journal.pone.0060895
Redaktør: Anna Alisi, Bambino Gesù barnesykehus, Italia
mottatt: 22 november 2012; Godkjent: 04.03.2013; Publisert: 16 april 2013
Copyright: © 2013 Boudiaf-Benmammar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den franske utdanningsdepartementet, forskning og teknologi, den algeriske departementet for høyere utdanning og forskning, Centre National de la Recherche Scientifique og Universitetet Paris Sud. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
for å sikre effektiv folding av begynnende polypeptidkjeder i en svært overfylt miljø celler har utviklet en klasse av proteiner som kalles molekylære anstand [1], [2]. Disse proteinene binder, i løpet av eller etter translasjon, utfoldet, delvis foldet og misfoldede polypeptidkjeder, ofte gjennom eksponerte hydrofobe segmenter [3]. Binding av molekylære anstand til sine kunder motvirker deres iboende aggregering tilbøyelighet og tillater en polypeptidkjede å søke folding landskapet og nå sitt native, funksjonell tilstand [4]. Molekylære anstand også styre protein homeostase under normale og stress forhold. De utgjør derfor en kvalitetskontroll system for vedlikehold av innfødte protein konformasjon, trans av proteiner over membraner og normal protein omsetning [2].
Involvering av molekylære anstand i kreftutvikling og progresjon er gjenstand for aktiv debatt. Flere studier rapporterer at anstand finnes i økte mengder ved mange solide svulster og hematologisk kreft [5], [6]. Deres ekspresjon kan delvis konto for evnen av maligne celler for å opprettholde homeostase protein i den ugunstige hypoksisk og sure mikromiljøet av tumoren. Gjennom deres interaksjon med viktige regulatoriske proteiner, molekylære anstand regulere cellesyklus og beskytter cellene mot programmert død. De fremmer tumorcelleoverlevelse, vekst og metastasering, selv i vekstfaktor belastede forhold, ved å tillate fortsatt proteintranslasjon og cellulær proliferasjon [7]. Til slutt blir molekylære anstand betraktes som kritisk for å tillate tumorceller til å tolerere genetiske forandringer som ellers ville være dødelig [5]. Faktisk molekylære anstand som HSP90 fungere som biokjemiske buffere for de mange genetiske lesjoner som er karakteristisk for de fleste humane kreftformer og stasjoner Oncogenesis [8].
Molecular anstand er allestedsnærværende proteiner som er produkter av distinkte, høyt konservert , genfamiliene. De er klassifisert i ulike kategorier basert på deres molekylmasser, cellular distribusjon og funksjon [9]. De hsp60 familiemedlemmer er særpreget ved at de danner høye molekylvekt ringformede proteinkomplekser. Disse partiklene er sanne foldenanomachines drevet av ATP og betegnes chaperonins. To klasser av chaperonins er definert [10]. De chaperonins som utgjør gruppe I utgjøres av en enkelt polypeptidkjede og har en syv gangers symmetri. Denne gruppen består GroEL [11] og det mitokondrielle motstykke cpn60. De chaperonins utgjør gruppe II har en 8 gangers symmetri og omfatter archaebacterial thermosomes og cytosoliske chaperonin hold t-kompleks polypeptid 1 (CCT) også kjent som TCP1 ring kompleks (tric) [12]; CCT /tric er en 16-subenheter kompleks sammensatt av to rygg-mot-rygg stablede ringer, hver med åtte forskjellige subenheter med omtrent 60 kDa (α, β, γ, δ, ε, ζ-1, η og θ) [13] ; [14]. CCT /tric samarbeider med protein kofaktorer å kaste mål klient proteiner. Hop /p60, en kofaktor Hsp70 og HSP90, øker folding effektivitet ved å tilrettelegge nucleotide utveksling [15]. Phosducin som protein 3 (PhLP3) er en negativ modulator av folding og begrenser klient protein tilgang til folding kammeret [16]. Endelig molekylære anstand prefoldin (PFD) modulerer også CCT /tric aktivitet som den leverer kunde proteiner [17], [18]
CCT /tric formidler folding av tubulins og actins [19].; [20] inkludert centrosomal γ-tubulin og centractin [21]. Den voksende liste av CCT /tric kunder omfatter proteiner involvert i tumor genesis med cyclin E [22], Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor protein [23], cyclin B og p21
ras [24]. Foruten sin kravet om actins og tubulins folding, det er dokumentert at CCT /tric er sterkt oppregulert i løpet av G1 /S fase overgang av cellesyklusen gjennom til tidlig S-fasen, og at denne hendelsen er kontrollert på mRNA-nivå [ ,,,0],25]. Videre er nedregulering av ekspresjonen CCTα forbundet med en inhibering av celleproliferasjon, en reduksjon i celleviabilitet, cellesyklus-stans og cellulær apoptose [26].
Til sammen disse observasjonene antyder sterkt at CCT /tric spiller en nøkkelrolle i cellecyklusprogresjonen og at det kunne bli involvert i tumorutvikling.
Her er vi kvantifisere i) uttrykket nivåer av CCT /tric og dets partnere som Hsc 70 og Hsp70 (Hsc /p70), PhLP3 , Hop /P60, prefoldin og DNAJB1 i kreft humane cellelinjer og ii) sin aktivitet i celleekstrakter. Totalt sett er ekspresjonsnivåene av CCT /tric i kreftcellelinjer som er høyere enn i normale celler. Påfallende men CCT /tric aktivitet ikke alltid korrelerer med sine uttrykk nivåer. Vi dokumentert derfor uttrykket nivåer av CCT /tric modulatorer. Vår analyse gir ny innsikt i rollen som protein folding maskiner i kreft celle utvikling.
Materialer og metoder
humane cellelinjer og celleekstrakter Forberedelse
Femten humane kreftcellelinjer , avledet fra cancer i forskjellige organer og som viser karakteristiske egenskaper, og en ikke-kreft cellelinje etablert fra normal foster lungevev ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). Tre andre cellelinjer som kommer fra andre kilder: SH-5YSY ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), OVCAR-8, en NCI-cellelinje, ble gitt av Dr. Liscovitch (Rehovot, Israel) og SF268 ble oppnådd fra National Cancer Institute (NCI Frederick, MD, USA). MIA PACA-2-, MRC5-SV2, HepG2 og KB-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). HCT116, SK-OV3, HT-29, K-562, HL-60, PC3, HeLa, MCF-7, MDA-MB-435s, MDA-MB-431, A549, SF-268, HCT15 og ovčar-8 celler ble rutinemessig dyrket i 10% FBS /RPMI 1640 supplert med penicillin-streptomycin, Fungizone og glutamin. SH-5YSY-celler ble dyrket i en blanding av DMEM og Ham F12-medium supplert med 10% FBS, glutamin og penicillin-streptomycin. Cellelinjene egenskaper og referanser er gitt i tabell 1.
Celler ble talt opp, vasket og høstet. Celletettheten ble justert til 24,10
7 celler /ml i lyseringsbuffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid). Suspenderte celler ble plassert på is og underkastet 10 sykluser med sonikering som består av en en andre impuls med en utgangseffekt på 10 watt i avstand av 15 sekunder ved anvendelse av en Branson sonifier 150 mens den humane lever-fragmentet (HNCL), som sted samling før 1995 følgende den etiske komiteen av Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE er beskrevet i [27], [28], ble homogenisert på is ved hjelp av en Kontes Teflon-glass homogenisator. Fullstendig cellelyse ble kontrollert ved hjelp av et mikroskop, og ionestyrken av ekstraktene ble justert til 140 mM Tris /HCl, pH 7,5, 14 mM MgCl
2, 1 mM DTT, 70 mM KCl, 4 mM ATP og 10% glycerol (v /v). Ekstraktene ble klaret ved sentrifugering ved 12 000 x g i 10 minutter ved 4 ° C, og proteinkonsentrasjonen i supernatantene ble bestemt ved Bradford-metoden [29]. Kanin retikulocyttlysat (RRL) fremstilt som tidligere beskrevet [30] ble anvendt som en kontroll i alle forsøkene.
Antistoffer
Mus polyklonale antistoffer mot human PhLP3 (anti TXNDC9), Hop /p60 ( anti STIP1) og PFD5 (anti PFDN5) ble kjøpt fra Abnova (Ontario, Canada). Mouse monoklonalt antistoff mot Hsc70 /p70 ble kjøpt fra StressGen (Victoria, BC, Canada). Kaninpolyklonalt antistoff til DNAJB1 ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Kanin polyklonalt antistoff mot CCTα ble generert i laboratoriet [24].
Western blotting
A standardserie omfattende CCTα (100, 50, 25, 12,5 ug /ml), PhLP3 (0,5, 0,25, 0,125 pg /ml), PFD5 (25, 12,5, 6,25 ug /ml), Hop /p60 (6, 3, 1,5 ug /ml) og Hsp70 (80, 40, 20, 10 ug /ml) ble løst etter SDS-polyakrylamid gelelektroforese (PAGE) under anvendelse av 12% polyakrylamidgeler [31] med to fortynninger (1/4 eller 1/8 og 1/16) av hver celleekstrakt og blottet på nitrocellulose-filter [32]. Hvert filter ble probet suksessivt med de fem primære antistoffer etter membran regenerering etter inkubasjon ved 50 ° C i 62,5 mM Tris /HCl pH 6,8, 100 mM β-merkaptoetanol og 2% SDS (v /v). Reaktive bånd ble visualisert ved chemiluminescence hjelp Pierce ECL Western blotting substrat (Thermo vitenskapelig, Rockville, USA) i henhold til produsentens anbefalinger og kjemiluminescens signalet ble digitalt fanget med en LAS-3000 lysende bilde analysator (Fujifilm). Alle eksperimenter ble utført minst i duplikat for biologiske replikater, tilsvarende uavhengige cellekulturer og middelverdier og standardavvik ble utledet fra de to uavhengige målinger. Mengdene av CCT /tric, PhLP3, PFD5 og Hop /p60 i de forskjellige ekstrakter ble kvantifisert ved å sammenligne luminescens i celleekstrakter til at med standarder med kjent konsentrasjon for elektroforese på den samme gelen.
Folding aktivitet analyse~~POS=TRUNC
[
35S] -merket utfoldet β-aktin target protein ble generert av uttrykk i
E. coli
og renset som beskrevet av Gao et al. [33]. Refoldingen aktiviteter celleekstrakter, RRL og HNCL ble analysert og analysert etter fortynning fra denatureringsmiddel av radiomerkede β aktin i celleekstrakter, RRL og HNCL utvannet i folding buffer (80 mM MES /KOH, pH 6,8, 1 mM MgCl
2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 1 mM ATP). Proteinkonsentrasjonen i løpet av de ekstraktene var 15 mg /ml eller 2,5 mg /ml. Reaksjonsproduktene ble løst i 6% ikke-denaturerende polyakrylamidgeler. Gelene ble deretter tørket og utsatt for et lagrings fosfor-skjerm (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA) og utviklet på en Storm PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Et eksempel på et CCT-mediert utbrettet β-aktin refoldingsreaksjonen er vist i figur S1. Alle eksperimentene ble kjørt i duplikat. De middelverdier og standardavvik ble utledet fra de to uavhengige målinger.
Cell Pakker Immuno-uttømming
To vilkårlig valgt celle ekstrakter (MIA-Paca-2 og OVCAR-8) og kontroll ble immuno-utarmet ved hjelp av enten anti- PhLP3, anti-Hop /p60, anti- PFD5, anti-Hsc /p70 eller anti-CCTα antistoffer. Ekstraktene ble inkubert i 2 timer ved 4 ° C under forsiktig bevegelse med tilstrekkelig antistoffet og de protein-antistoffkomplekser ble sedimentert etter inkubering over natten ved 4 ° C med protein A Sephrose CL-4B-perler (GE Healthcare) ekvilibrert i 50 mM Tris -HCI, pH 7,0. Supernatantene ble gjenvunnet, ble proteinkonsentrasjonen målt og evne til immuno-utarmet ekstrakt for å refolde [
35S] -merket utbrettet β-actin ble analysert
in vitro
.
bilde~~POS=TRUNC, statistisk analyse og beregninger
Digitale bilder oppnådd med Fujifilm LAS-3000 analysator og Storm PhosphorImager ble analysert ved hjelp av programvaren NIH image (US National Institute of Health, Bethesda, MD).
intensiteter avledet fra bildeanalyse ble analysert ved hjelp av to-utvalg, ensidige uavhengig Student t-tester.
antall CCT /tric og PFD partikler per celle ble avledet fra konsentrasjonsmålinger ved hjelp av følgende ligning : Hvor n er antallet CCT /tric eller PFD partikler, C, mengden av CCT /tric eller PFD estimert fra Western blot målinger ved sammenligning med kjente mengder av CCTα eller PFD5 i mg /ml, C
N, er antall celler /ml, Mw, er molekylvekten av CCT /tric eller PFD partikler (750000 for CCT /tric, 100 670 for PFD) og
N
konstant av Avogadro (6,023 × 10
23).
Resultater
CCT /tric Expression og aktivitet
CCT /tric er strengt nødvendig for folding av de to hoved cytoskeletal proteiner actins og tubulins
i vivo
. Men lite er kjent om sitt uttrykk og aktivitet i kreftceller. Vi sammenlignet uttrykket nivåer og aktivitet av CCT /tric i 18 kreftcellelinjer fra ulike organer og en normal cellelinje (MRC5-SV2), et menneske som ikke er kreft leverhomogenat (HNCL) og kanin retikulocyttlysat (RRL), hvor CCT /tric er kjent for å bli uttrykt og høyaktivt. Kvantifisering av CCT /tric på Western-blots (figur 1) viste at den gjennomsnittlige konsentrasjon av CCT /tric i kreftcelleekstrakter er omtrent 5 ug per mg av totale proteiner og omtrent 3 til 4,10
8 CCT /tric partikler ( se eksperimentelle prosedyrer seksjon for beregning Tabell S1 for CCT /tric partikler tall i de ulike cellelinjer), bortsett fra MIA-PaCa2, MRC5-SV2, MDA-MB-231 og HL-60 cellelinjer hvor CCT /tric beløpene er 2-3 -gangers den gjennomsnittlige verdien. I HNCL og RRL, er mengden av CCT /tric halvparten av gjennomsnittet målt for kreftcellelinjer. Det er også verdt å merke seg at dette beløpet er det laveste (1.6μg /mg av totale proteiner) i den menneskelige neuroblastom SH-SY5Y cellelinje. CCT /tric uttrykk således vises oppregulert i alle kreftcellelinjer, særlig i MIA-PaCa2, MDA-MB-231 og HL-60-cellelinjer (figur 1). For å bestemme hvorvidt CCT /tric uttrykk korrelerer med dens aktivitet vi kvantifisert radioaktivt merket, denaturert, aktin folding i celleekstrakter supplert med Mg
2+ og ATP, som beskrevet i den eksperimentelle prosedyrer delen. Resultatene, vist i figur 2 viste at CCT /tric aktivitet ikke alltid korrelerer med sin ekspresjonsnivå. Faktisk, mens brette aktiviteten til CCT /tric i MIA-PaCa2, MDA-MB-231 og MDA-MB-435s cellelinje ekstraktene var svært konsistent med de viktige nivåer av CCT /trisk innenfor ekstraktene, ble det funnet meget lav i HL-60 cellelinje ekstrakt, dvs. cellelinje som inneholder de høyeste mengder CCT /tric, sammenligne Figur 1 Figur 2.
Hvor mye CCT /tric i 18 kreft og en normal (MRC5-SV2) cellelinjer ekstrakter, fremstilt som beskrevet i den eksperimentelle prosedyrer delen, et ikke-kreft leverhomogenat (HNCL) og kanin retikulocyttlysat (RRL) ble bestemt ved å sammenligne CCTα intensitet målt for celleekstrakter fortynnes 4 og 16 ganger den for kjente mengder CCTα (100, 50, 25, 12,5 ug /ml) migrert på den samme 12% SDS polyakrylamidgel ved Western blotting. De gjennomsnittlige mengder CCT /tric i de forskjellige ekstrakter er uttrykt som en funksjon av de totale proteinene innholdet av ekstraktene.
CCT /tric folding aktivitet i løpet av 18 cancercellelinjer, er den normale cellelinjen MRC5-SV2 og det humane ikke-kreft leveren ble målt ved hjelp av [
35S] -merket, denaturert β-actin folding, som beskrevet i den eksperimentelle prosedyrer delen. Reaksjonsproduktene ble analysert på 6% ikke-denaturerende polyakrylamidgeler. CCT /tric spesifikk aktivitet, avledet fra kvantifisering av p-aktin bånd intensiteter er uttrykt som en funksjon av total proteinkonsentrasjon. Bildene, som er tatt opp ved hjelp av en phosphorimager for [
35S] -merket aktin refolding reaksjoner i folding buffer, RRL, MIA-Paca-2 og HeLa celleekstrakter løses på en innfødt 6% polyakrylamid gel, er vist i innfelt.
uttrykk av CCT /tric aktivitet modulatorer
Som uttrykket nivået av CCT /tric ikke korrelerer med sin aktivitet og for bedre å forstå hvordan sistnevnte er modulert i kreftceller, vi kvantifisert CCT /tric aktivitet modulatorer, prefoldin, Hop /P60 og PhLP3, i cellelysatene. Dataene presentert i Figur 3A viser at Hop /p60-konsentrasjonen i de cellelinjer som vi brukte er ca. 0,4 ug /mg av totalt protein i gjennomsnitt. Hop /p60 vises under-uttrykt i de fleste av cellelinjene vi brukte når dens ekspresjonsnivået er normalisert til at i den ikke-kreft leverhomogenat (HNCL) anvendt i denne studien (figur S2). Hop /p60 uttrykk er den høyeste i MRC5-SV2, HCT116, PC3 og HL-60 cellelinjer som det er i HNCL.
Hvor mye (A) Hop /p60, (B) PhLP3 og (C ) PFD i 18 kreft og en normal (MRC5-SV2) cellelinjer ekstrakter, et ikke-kreft leverhomogenat (HNCL) og kanin retikulocyttlysat (RRL) ble bestemt ved sammenligning av kjemiluminescens-signal som er registrert for Hop /p60, PhLP3 og PFD i celleekstrakter fortynnes 4 og 16 ganger den for kjente mengder av proteiner på samme Western blot.
CCT /tric uttrykk er også høy i MRC5-SV2 og HL-60. Overraskende er imidlertid gitt at Hop /p60 er en nukleotid-utveksling faktor antas å favorisere CCT /tric-mediert folding, er sammenleggbare aktiviteten til MRC5-SV2 og HL-60-celleekstrakter lav. Tilsvarende, mens CCT /tric og Hop /P60 konsentrasjonene er forholdsvis høy i HCT116 celleekstrakter, er folde aktivitet av ekstrakt blant de laveste. Vi konkluderer ut fra disse observasjonene at uttrykket nivået på Hop /p60 er ikke ansvarlig for økt eller redusert CCT /tric-mediert folding effektivitet. Vi dokumentert derfor PhLP3, funksjonell antagonist av Hop /p60, uttrykk i kreftcellelinjer vi brukte. PhLP3 uttrykk varierer betydelig fra en cellelinje til en annen. Proteinet ble ikke påvises i 11 cancercellelinjer vi brukte og fra 0,03 ug /mg av totalt protein (figur 3B) i 8 andre cellelinjer. Når påviselig, vises PhLP3 løpet uttrykk da dens uttrykk nivået er normalisert til at i HNCL (figur S2). Her igjen, var vi ikke i stand til å relatere en høy PhLP3 uttrykk nivå med en lav CCT /tric aktivitet. Faktisk er PhLP3 konsentrasjon blant de høyeste i PC3 og MDA-MB-231 celleekstrakter (Figur 3B) hvor CCT /tric aktivitet er blant de høyeste (figur 2).
Vi endelig kvantifisert prefoldin uttrykk nivåer som dette co-anstand bistår CCT /tric i buffer klient proteinkonsentrasjoner i cytosol og levere dem til CCT /tric. Prefoldin konsentrasjon varierer lite fra en celle til en annen og er i gjennomsnitt 2 ug /mg av totalt protein (figur 3C). Prefoldin uttrykk nivå er dobbelt lavere enn gjennomsnittet i MIA-PaCa2, MRC5-SV2, HCT116, SH-SY5Y og SK-OV-3 celleekstrakter og er betydelig høyere enn gjennomsnittet i HL-60, K562, HeLa, KB, MDA -MB-231 og MCF7 celleekstrakter. Dermed en korrelasjon mellom CCT /tric aktivitet og uttrykket nivået av prefoldin. Den høyeste prefoldin uttrykkes, er den laveste aktiviteten til CCT /tric. Til slutt er det verdt å merke seg at PFD er uttrykt til høyere nivåer i alle kreftcellelinjer i forhold til HNCL (figur S2). Ettersom dette protein er en del av et kompleks bestående av 6 subenheter, gjennomsnittlig antall aktive partikler per celle i området 5-24 10
8 (tabell S1).
Mangel på sammenheng mellom økt eller redusert uttrykk nivåer av Hop /p60 og PhLP3 og CCT /tric aktivitet tyder på at sistnevnte ikke er effektivt modulert av disse polypeptider. For å sørge for at dette virkelig er tilfelle og bedre forstå hvordan Hop /p60 og PhLP3 påvirke CCT /tric folding aktivitet, undersøkte vi konsekvensene av immuno reduserende Hop /p60 eller PhLP3 fra to tilfeldig utvalgte celleekstrakter: MIA-Paca-2 ( Figur 4A) og OVCAR-8 (figur 4C) på CCT /tric aktivitet. Immuno-uttømming av Hop /p60 hadde ingen effekt på CCT /tric aktivitet (figur 4B, D). I motsetning til dette, PhLP3 immuno-uttømming fra et celleekstrakt, hvor det er betydelig uttrykkes, slik som OVCAR-8, førte til en dramatisk reduksjon i CCT /tric aktivitet (figur 4B, D). Dette tyder på det sterkeste at PhLP3 er tungt involvert i moduler CCT /tric aktivitet.
CCT /tric folding aktivitet i (A) MIA-Paca-2 og (C) OVCAR-8 celle ekstrakter før og etter CCT /tric , Hop /p60 eller PhLP3 immunodepletion ble analysert ved hjelp av [
35S] -merket, denaturert β-aktin. Proteinkonsentrasjonen av de MIA PACA-2-og OVCAR-8-celleekstrakter var 2,5 og 15 mg /ml, respektivt. Native β-aktin bandet intensiteten ble målt ved hjelp av en PhosphorImager. Mengden av nativt β-actin målt etter immunodepletion er uttrykt som en fraksjon av den mengde målt for celleekstrakter før immunodepletion i (B) MIA-PACA-2 og (D) OVCAR-8 celleekstrakter.
Hsc /p70 modulere CCT /tric aktivitet
CCT /tric samarbeider med andre molekylære anstand [2]. HSC 70 og Hsp70 (HSC /p70) er blitt vist å fremme klient proteiner som binder til CCT /tric for eksempel [34], [35]. For å avgjøre om HSC /p70 uttrykk nivåer korrelerer med at av CCT /tric aktivitet, ble mengder av Hsc /p70 i kreftcellelinje ekstrakter vi brukt i denne studien kvantifisert ved Western blotting. Dublettpulsen band observert på blotter stammer fra det konstituerende (Hsc70, 73 kDa) og stress indusert form (Hsp70, 72 kDa) av anstand. Hsp70 vises overexpressed i cellelinjene vi brukt som vitne av intensiteten av de letteste band i Western blot. Dette tyder sterkt på at stress-assosiert form av anstand induseres i kreftcellelinjer. Mengden av Hsc /p70 i de ulike celleekstrakter vi målt er 5 mikrogram /mg av totalt antall proteiner i gjennomsnitt med unntak av MRC5-SV2, A549, K-562, MDA-MB-435s og KB cellelinjer hvor Hsc /p70 konsentrasjonen er 2-3 ganger høyere og SH-5YSY hvor det er to ganger lavere (figur 5). Likeledes, i bryst adenokarsinom-cellelinje MCF7 og hepatokarsinom cellelinje HepG2, Hsc /p70 er 7 til 12 ganger den gjennomsnittlige verdien. Til slutt er det verdt å merke seg at Hsc /p70 ekspresjon blir oppregulert i alle kreftcellelinjer med ekspresjonsnivåer rekk i HepG2 celler 160 ganger det som er innenfor den ikke-kreft leverhomogenat (HNCL) anvendt som en referanse i HepG2-celler (Figur 5).
mengden av Hsc /p70 i 18 kreft og en normal (MRC5-SV2) cellelinjer ekstrakter, et leverhomogenat (HNCL) og kanin retikulocyttlysat (RRL) ble bestemt ved sammenligning av kjemiluminescens-signal som er registrert for Hsc /p70 i celleekstrakter fortynnes 4 og 16 ganger den for kjente mengder av proteinet på samme Western blot. De gjennomsnittlige mengder av Hsc /p70 i de forskjellige ekstrakter er uttrykt som en funksjon av de totale proteinene innholdet av ekstraktene.
Våre resultater tyder på at CCT /tric aktivitet er blant de laveste i cellelinjer som uttrykker de høyeste Hsc /p70 nivåer (sammenlign CCT /tric aktiviteten til de mengder Hsc /p70 i MCF7 HepG2 og K-562). Tilsvarende ser CCT /tric aktivitet de høyeste i cellelinjen ekstrakter hvor Hsc /P70 nivåene er lavere enn gjennomsnittet (sammenligne CCT /tric aktiviteten til de mengder Hsc /p70 i MIA-Paca-2, HCT15, PC-3 og MDA -MB-231). Dette kan godt være konsekvensen av klienten protein fordeling mellom Hsc /p70 og CCT /Tric med økte mengder av klient proteiner utilgjengelig for binding til CCT /tric i nærvær av høye HSC /P70 konsentrasjoner.
For ytterligere dokumenter HSC /p70 og CCT /tric samarbeid i proteinfolding, analysert vi CCT /tric klient proteinfolding aktivitet i kreftcelleekstrakter følgende Hsc /p70 immunodepletion. Dataene presentert i Figur 6 viser klart at CCT /tric-mediert p-aktin sammenleggbare reduseres med over 65% på MIA PACA-2-og OVCAR-8 på Hsc /p70 immunodepletion. Disse resultatene viser tydelig at Hsc /p70 og CCT /tric samarbeide.
CCT /tric-mediert merket, denaturert β-aktin folding i (A) MIA-Paca-2 og OVCAR-8 celle ekstrakter før og etter HSC /p70 immunodepletion. Proteinkonsentrasjonen av de MIA PACA-2-og OVCAR-8-celleekstrakter var 2,5 og 15 mg /ml, respektivt. Native β-aktin bandet intensiteten ble omkodet ved hjelp av en PhosphorImager. Mengden av nativt β-actin målt etter immunodepletion er uttrykt som en fraksjon av den mengde målt for celleekstrakter før immunodepletion i (B) MIA-PACA-2 og (C) OVCAR-8 celleekstrakter.
Våre observasjoner er kompatible med det syn at Hsc /p70 buffere CCT /tric klient proteiner [36]. Faktisk immunodepletion av Hsc /p70 fører til en reduksjon av CCT /tric klient polypeptid bassenget på grunn av en reduksjon av mengden tilgjengelige CCT /tric klient proteiner.
Diskusjoner
CCT /tric spiller en sentral rolle i celleproliferasjon gjennom sin evne til å lette brettingen av i) – cytoskeletal proteiner involvert i celledelingen, f.eks α, β og y-tubulins [23], [15], [31], [25], a og p actins og centractin [14], [36], [25], ii) – oncoproteiner som for eksempel cyclin E [ ,,,0],22], Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor protein [23], cyclin B og p21
ras [24]. CCT /tric uttrykk er dessuten oppregulert under G1 /S faseovergangen av cellesyklusen [25], mens den nedregulering fører til hemming av celleproliferasjon, en reduksjon i celleviabilitet, cellesyklus-stans og cellulær apoptose [26 ].
for å avgjøre om CCT /tric aktivitet avhenger bare av sitt uttrykk nivå, vi sammenlignet uttrykket nivåer av CCT /tric i 18 humane kreftcellelinjer, en normal cellelinje og et normalt menneske lever. Vi viste at CCT /tric aktivitet ikke alltid korrelerer med sitt uttrykk nivå. Vi kvantifisert derfor CCT /tric aktivitet modulatorer i kreftcellelinjer som er brukt i denne studien. Vi viste at Hop /p60 er ikke ansvarlig for økt eller redusert CCT /tric-mediert folding effektivitet. Tilsvarende var vi ikke i stand til å avdekke en sammenheng mellom PhLP3 uttrykk nivå og CCT /trisk aktivitet i cellelinjene hvor PhLP3 uttrykk var synlig. Vi kvantifisert derfor nivåer av proteiner som hjelper spesielt CCT /tric som prefoldin eller buffere klient proteiner basseng i cytoplasma som Hsc /p70. Vi har vist at jo høyere prefoldin er uttrykt, er den lavere aktiviteten til CCT /tric. Vi viste også at CCT /tric aktivitet er den høyeste i cellelinjen ekstrakter hvor Hsc /P70 nivåene er lavest. Disse funnene sterkt at klient proteiner skillevegg mellom prefoldin og /eller Hsc /p70 og CCT /tric. I nærvær av høy prefoldin og /eller HSC /P70 konsentrasjoner, er en betydelig andel av klient proteiner bufret av de sistnevnte molekylære anstand og utilgjengelig for binding til CCT /tric mens når prefoldin og /eller HSC /P70 konsentrasjonene er lave brøkdel av klient proteiner bundet til CCT /tric øker. Dermed variasjoner i uttrykket nivåer av prefoldin og /eller Hsc /p70 modulere tilgjengeligheten av klienten protein for CCT /tric. Dette illustreres av det funn at immuno-uttømming av Hsc /p70 cytosoliske basseng fører til en utarming av sequestered klient proteiner og en signifikant reduksjon i steady state CCT /tric aktivitet. Oppdagelsen av at antallet CCT /tric og prefoldin partikler i cytosol av kreftcellelinjer som ikke avviker med mer enn en størrelsesorden indikerer enten at brettemaskiner har utviklet seg på en slik måte at prefoldin og /eller Hsc /p70-funksjon i forbindelse med CCT eller at den maksimale mengde av klient polypeptider foldemaskiner kan lagre /buffer og cellen kan romme er av samme størrelsesorden enn den for CCT /tric partikler. Dette er spesielt sant når det gjelder trekning av polypeptider tilknyttet prefoldin og /eller Hsc /p70 i cytoplasma representerer den eneste kilden til CCT /tric klient proteiner.
Totalt avslører vår studie en funksjonell samspill mellom molekylære anstand som kan står for en presis modulering av CCT /trisk aktivitet i cellevekst gjennom endringer i den cellulære nivåer av prefoldin og /eller Hsc /p70. Våre observasjoner viser også at tilgjengeligheten av klienten protein for CCT /tric er den begrensende trinnet som modulerer CCT /tric aktivitet. Faktisk, økt prefoldin og /eller HSC /P70 intracellulære konsentrasjoner fører til redusert mengder av gratis klient proteiner og motvirke CCT /tric aktivitet. Tilsvarende økning av mengden av klienten proteinkonsentrasjonen på et gitt prefoldin og /eller HSC /P70 konsentrasjons gir gratis klient proteiner og gjenoppretter CCT /tric aktivitet. Således, en tredelt samspill mellom CCT /tric, prefoldin og /eller Hsc /p70, på den ene side, klient proteiner, på den annen side synes kritisk for modulering av celleproliferasjon, spesielt i en sammenheng der cytoskeletal og onco-proteiner som er avgjørende for celledeling og levedyktighet er blant de viktigste kunder av CCT /tric.
HSC /p70 co-anstand fra Hsp40 familien modulerer samspillet mellom Hsc /p70 med sine klient proteiner [37]. Vi har derfor kvantifisert ekspresjonsnivået av en av de store induserbare Hsp40 familiemedlemmer [38] i kreftcellelinjer som er brukt i denne studien. DNAJB1 Ekspresjonsnivået er det høyeste på MIA PACA-2-, MDA-MB-231 og HT29-celler (ikke vist). Denne observasjonen er i overensstemmelse med en høyere omsetning av HSC /P70-bundet klient proteiner og den påfølgende over gjennomsnittlig CCT /tric aktivitet målt for disse ekstrakter. Men DNAJB1 uttrykk nivåer var relativt beskjeden i to andre cellelinjer (HCT15 og PC-3) som viser over gjennomsnittet CCT /tric aktivitet.
